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Veterinaria Trop. 09: 3-15 1984 CULTIVO DE C�LULAS
BHK21 CLON 13 EN SUSPENSI�N: J. Obreg�n*, P. Ramos*, J. Aponte* y N. Conde* * FONAIAP. Centro
Nacional de Investigaciones Veterinarias |
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RESUMEN En el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Celulares del Instituto de Investigaciones Veterinarias (CENIAP-FONAIAP), se utiliza la l�nea celular BHK 21 clon 13, adaptada a cultivos en suspensi�n para la multiplicaci�n del virus de la fiebre aftosa, la cual se utiliza como ant�geno en la producci�n de vacuna antiaftosa inactivada. Con el prop�sito de aumentar la producci�n celular, se construy� un fermentador sencillo experimental de 12 litros, con aireaci�n al cultivo, lo cual permite el m�ximo aprovechamiento del volumen de cultivo disponible y la optimizaci�n del desarrollo de la poblaci�n celular. Partiendo de una densidad celular inicial promedio de 7 x 105 cel/ml (D.S.: � 0,20 x 105) se alcanza una densidad celular final de 1,81 x 106 cel/ml (D.S.: � 0,79 x 105), en un lapso de tiempo de 22,9 horas (D.S.: � 2,5), lo que significa un �ndice de multiplicaci�n de 2,5 (D.S.:� 0,67) y una producci�n total de 1,05 x 1010 c�lulas por cultivo. En este trabajo se describe la t�cnica empleada para aumentar la producci�n celular. INTRODUCCI�N El creciente inter�s dedicado a los campos de investigaci�n viral y producci�n de vacuna, ha tra�do como consecuencia la necesidad de incrementar la producci�n del cultivo masivo de c�lulas eucari�ticas. En muchos laboratorios se utiliza la l�nea celular BHK 21 clon 13, adaptada a cultivos en suspensi�n para la replicaci�n del virus de la fiebre aftosa (2,6), la cual se aprovecha como ant�geno para la producci�n de vacuna. En el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Celulares, del Instituto de Investigaciones Veterinarias (CENIAP-FONAIAP) se utiliza un m�todo de cultivo mixto (monocapa-suspensi�n-monocapa), tripsinizando monocapas adaptadas para desarrollar cultivos en suspensi�n y finalmente sembrarlos en frascos rotatorios para obtener monocapas susceptibles al virus de la fiebre aftosa (7). En la etapa de cultivo en suspensi�n convencional se usan botellas Pyrex de 8 litros, aprovechando s�lo el 30% (2,5 litros aproximadamente) de su volumen, debido a que la poblaci�n celular utiliza para su respiraci�n �nicamente el aire presente en el envase. Se podr�a considerar el vaso de cultivo como un sistema de di�lisis en el cual un nutrimento (ox�geno) se difunde a trav�s de la interfase gas-l�quido y se disuelve en el cultivo. Existe una relaci�n entre la m�xima tasa de crecimiento y la m�xima tasa de soluci�n de ox�geno en el cultivo, �ste incrementar� su poblaci�n hasta el punto en que el sistema suministre ox�geno a su m�xima capacidad; desde este momento, el incremento celular tender� a ser lineal (1) y el ox�geno se habr� convertido en el nutrimento limitante. Al respecto, Deschaux et al. (4) estudiaron el metabolismo respiratorio de las c�lulas BHK Clon 13, se�alando que su actividad respiratoria es m�s intensa, precoz y durable que en cultivos en monocapa. Con el prop�sito de obviar esta limitante, se realizaron varias experiencias aireando cultivos de BHK 21 Clon 13 en suspensi�n, que condujeron al dise�o de un aparato fermentador cuya construcci�n y t�cnica de operaci�n se describen en el presente trabajo. MATERIALES Y M�TODOS Materiales Frasco aspirador
Schott de 15 litros 4203/NS 60 Reactivos Soluci�n salina
fosfatada (PBS) Medio Minimum Essential
Medium (Eagle) GIBCO Cat. N� 4101100 CONSTRUCCI�N DEL APARATO FERMENTADOR El vaso fermentador consiste en un frasco Schott de 15 litros, el cual posee tres aberturas, dos superiores y una inferior, en las cuales se acomodan los tapones que portan los elementos del aparato. La Figura 1 muestra la disposici�n general de los componentes. El tap�n superior N� 13 est� atravesado por los siguientes elementos:
Los tubos de metal y de vidrio fueron sellados al tap�n N� 13 con cemento de resinas ep�xicas marca DURO. Esta resina sint�tica soporta el proceso de esterilizaci�n por autoclave. La otra abertura superior est� obturada por un tap�n N� 6 que sostiene un filtro de aire, el cual usa como elemento filtrante algod�n de fibra de vidrio, �ste permite el escape de gases al exterior del aparato. Finalmente, el orificio inferior tiene un tap�n N� 6, el cual puede ser atravesado as�pticamente por una aguja hipod�rmica para tomar muestras o agregar antiespumante. La corriente de aire que penetra al aparato es esterilizada por filtraci�n. El sistema de filtraci�n de gases consta de dos filtros conectados en serie:
Es importante destacar que cualquier frasco puede ser utilizado como vaso de fermentaci�n, reacomodando los elementos en el espacio disponible, pero respetando siempre el dise�o b�sico del sistema de aireaci�n/agitaci�n. M�todo de operaci�n La suspensi�n madre empleada en el fermentador se prepara con monocapas de c�lulas BHK adaptadas a suspensi�n y sembradas en frascos Pyrex de 8 litros (con sif�n, filtro de aire y magneto), a raz�n de 2,5 litros y con una densidad celular inicial estimada entre 6 y 7 x 105 cel /ml. Este cultivo se lleva a 37�C durante aproximadamente 22 horas, con una agitaci�n magn�tica de 200 r.p.m.. Transcurrido el periodo de tiempo indicado se procede a efectuar el contaje celular correspondiente, calcul�ndose que el cultivo debe haber alcanzado una concentraci�n celular que permita la siembra del fermentador, con un volumen oscilante entre 5-6 litros y densidad celular entre 5-7 x 105 cel/ml. Una vez cargado el aparato de fermentaci�n con la suspensi�n madre, se lleva a estufa a 37�C y se conecta la bomba de aire al ducto de entrada del sistema de filtraci�n de gases, ajustando la corriente de aire a un flujo aproximado de dos burbujas/segundo, con la pinza destinada a tal efecto. Se calibra la velocidad de agitaci�n magn�tica a 300 r.p.m., dej�ndose el cultivo a 37�C durante un per�odo comprendido entre 22-24 horas. Transcurrido el tiempo de incubaci�n se�alado, se toman las muestras para determinar la esterilidad, pH y concentraci�n celular (se estima una poblaci�n celular de 1,6 x 106 con una desviaci�n standard de � 4 x 105 cel/ml. A continuaci�n se agrega medio Eagle con 10% de suero bovino a trav�s del tubo de siembra del fermentador, llev�ndolo a un volumen operacional de 12 litros, dej�ndose en incubaci�n bajo las condiciones antes descritas. Posteriormente se efect�a la cosecha de parte de la suspensi�n, dejando en el aparato suficiente cultivo para llevarlo a un volumen de 12 litros, con una densidad de 7 x 105 cel/ml. Esta operaci�n se repite diariamente durante la semana, cosechando suspensi�n todos los d�as manteniendo el volumen de cultivo del fermentador hasta su cosecha final. Una vez obtenido el volumen de suspensi�n celular, de acuerdo con las necesidades existentes, se procede a la siembra de los frascos roller. Siete litros de suspensi�n celular, conteniendo 1,2 x 106 cel/ml, se mezclan con 10 litros de medio MEM Eagle con 10% de suero bovino, reparti�ndose 400 ml de esta suspensi�n a cada frasco roller, por lo cual cada uno fue sembrado con 2 x 108 c�lulas. Una vez sembrados, los frascos roller se llevan a estufa a 37�C, con rotaci�n de 0,5 r.p.m. durante 72 horas, per�odo de tiempo en el cual se completan las monocapas, procedi�ndose a inocularlas con el virus para obtener su multiplicaci�n. RESULTADOS Mediante este m�todo se han obtenido suspensiones celulares de concentraciones uniformes, con las cuales ha sido posible cultivar c�lulas en monocapas en frascos rotatorios en escala semi-industrial. Las densidades celulares m�ximas promedio est�n en el orden de 1,81 x 106 cel/ml (D.S. 0,79 x 105), en un lapso de tiempo de 22,9 horas (D.S. 2,5), partiendo de una densidad celular inicial de 7 x 105 cel/ml. Esto permite producir semanalmente aproximadamente 30 litros de suspensi�n, suficientes para sembrar unos 300 frascos rotatorios los cuales una vez infectados con virus rinden 80 litros de ant�geno para vacuna, cifras que podr�an ser mayores al disponerse de una bacteria de fermentadores. La eficiencia de producci�n con respecto a la suspensi�n convencional es de un 150% y el ahorro de tiempo es de 10%. Asimismo, se evidenci� la susceptibilidad de las monocapas, provenientes de la suspensi�n, al virus de la fiebre aftosa, ya que se lograron t�tulos serol�gicos e infeccioso que cumplen con las exigencias de la t�cnica de elaboraci�n de la vacuna antiaftosa inactivada (3). Por otra parte, el m�todo descrito permite el total aprovechamiento del volumen de cultivo �til y la disminuci�n de los riesgos de contaminaci�n bacteriana de los cultivos, requiriendo menos manipulaciones. El Cuadro 1 presenta los resultados de cultivos celulares llevados a cabo en el aparato fermentador y la Figura 2 muestra la curva caracter�stica de crecimiento de la poblaci�n contra tiempo.
DISCUSI�N La aireaci�n del cultivo parece prolongar la fase logar�tmica de crecimiento y posponer la fase estacionaria, debido a que elimina el problema de la depresi�n de la concentraci�n de ox�geno disuelto y, probablemente, permite la oxidaci�n de los �cidos org�nicos de desecho y la elevaci�n del pH. En los experimentos no se intent� el control del pH; sin embargo, �ste se mantuvo en un promedio de 7,2 (D.S. 0,16). Fontages et al. (5) demuestran que el control de pH no es necesario en fermentadores peque�os, pero es imperativo en fermentadores de mayor capacidad. El fermentador aqu� descrito tiene la ventaja de la simplicidad y sencillez de construcci�n, operaci�n y mantenimiento; puede ser �til en experimentos pilotos para prop�sitos de propagaci�n masiva de l�neas celulares animales en suspensi�n, producci�n de semilla para fermentadores industriales y entrenamiento de personal en esta t�cnica de producci�n; asimismo, se podr�a adaptar al cultivo de diversas cepas bacterianas. En todo caso, en cultivos de organismos pat�genos deber�n tomarse precauciones estrictas y tratar los gases de escape del aparato antes de permitir su salida a la atm�sfera. SUMMARY The Laboratory of Celular Tissue Culture at Instituto de Investigaciones Veterinarias (FONAIAP-CENIAP) uses the continuos cell line BHK 21 clon 13 adapted to grow in suspension for the multiplication of the foot-and-mouth disease virus, which is used as antigen for the production of an inactivated vaccine. With the purpose of increasing the celular production it was built a simple, 12 liter capacity, experimental fermenter with aeration to the culture which optimized the use of the volumen available and improves the conditions for the development of the celular population. Starting with a average initial density of 7 x 105 cel/ml (S.D.� 0,20 x 105), a final celular density of 1,81 x 106 cel/ml (S.D.: � 0,79 x 105) was reached within 22,9 hours (S.D. � 2,5) which means a multiplication rate of 2,5 (S.D.: � 0,67) and a total production of 1,05 x 1010 cells per culture. The details for the construction of the fermenter and the techniques to operate it are described. AGRADECIMIENTO Se agradece al Dr. Jes�s Casta�eda el apoyo y estimulo; al Lic. Juan Ernesto Ludert, por la revisi�n y discusi�n del presente trabajo; al Centro Panamericano de Fiebre Aftosa, instituci�n que imparti� la formaci�n t�cnica, y a la Sra. Irma Puerta de Fuentes, por su trabajo secretarial. BIBLIOGRAF�A 1. BAUER, S. y J. SHILOACH. Maximal exponential growth rate and yield of E. coli obtainable in a benchscale fermentator. Biotechnol. Bioeng. 16:933. 1974. 2. CAPSTICK, P.B., R.C. TELLING, W.G. CHAPMAN y D.L. STEWART. Growth of a cloned strain of hamster kidney cells in suspended culture and their susceptibility to the virus of food-and-mouth disease. Nature 195: 1163, 1962. 3. CENTRO PANAMFRICANO DE FIEBRE AFTOSA. Manual de procedimientos para el control de vacuna antiaftosa. Ri� de Janeiro, 1980 48p. (Serie de Manuales T�cnicos N� 2) 4. DESCHAUX, P., C. JOPPIN y R. FONTAGES. Etude comparative des m�tabolismes prot�iques et des syst�mes enzymatiques respiratoires entre des cellules BHK 21 cultiv�es en suspension et en couche monocellulaire. C.R. Soc.Biol. 164:2269. 1970. 5. FONTAGES, R., P. DESCHAUX e Y. BEAUDRY. Apparatus for continuous, large-volume suspended cell cultivation. Biotechnol. Bioeng. 13:457. 1971. 6. MOWAT, G.N. y W.G. CHAPMAN. Growth of foot-and-mouth disease virus in a fibroblastic cell line derived from hamster kidneys. Nature 194:253. 1962. 7. RAMOS, P.M., J.M. OBREGON, A. MALDONADO, N. NOGUERA y H. DELGADO. Producci�n de c�lulas BHK 21 clon 13 en suspensi�n: sistema utilizado en el Servicio de Vacuna Inactivada del Instituto de Investigaciones Veterinarias. 19 Convenci�n Anual de la AsoVac (Resumen). Memorias, p.33. 1979. |
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