Veterinaria Tropical 22(1): 13-29. 1997

José M. Obregón H.* y Pedro M. Ramos V.*

¹Este artículo es parte del trabajo presentado por Obregón J.M. y P.M. Ramos.
"Producción de antígeno para la elaboración de vacunas.
Método desarrollado por el Departamento de Inmunobiológicos y  Control de Instituto de Investigaciones
 Veterinarias (FONAIAP-CENIAP)" 
galardonado con el premio "Honor al Mérito Tecnológico del Estado Aragua 1994 
otorgado por la Gobernación del Estado y FUNDACITE Aragua.
*TAI  I e Investigador V, respectivamente. FONAIAP.
Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias. Instituto de Investigaciones
 Veterinarias. Avenida Las Delicias. Maracay 2102. Venezuela
Recibido: Abril 30, 1996.

 RESUMEN 

Se describe un método sencillo de producción de antígenos inactivados del virus de estomatitis vesicular (VEV). El sistema, de fácil construcción y operación, esta basado en la multiplicación de cepas patógenas del VEV en cultivos celulares de BHK₂₁ C₁₃ en suspensión y produce unos 40 1 semanales de virus con títulos infecciosos promedio de 7,38 (±0,74) log₁₀DL₅₀RL /ml. Inoculando una población de 2,0 -2,5 x 10⁶ cel/ml con una multiplicidad de infección de 0,01- 0,05 DL₅₀RL/célula los máximos títulos infecciosos se obtienen en 18- 22 horas post-infección. Estos antígenos una vez inactivados se utilizan en la formulación de vacunas experimentales. Los resultados indican que los cultivos celulares de BHK₂₁ C₁₃ en suspensión, en escala industrial, pueden ser usados para la producción comercial de vacunas contra la estomatitis vesicular. 

Palabras Clave: Virus estomatitis vesicular; antígeno inactivado; BHK₂₁ C₁₃ en suspensión. 

INTRODUCCIÓN 

El virus de estomatitis vesicular (VEV) periódica e impredeciblemente causa epizootias en bovinos, suinos y equinos únicamente en el hemisferio occidental (HANSON, 1952,1984) produciendo vesículas en las membranas mucosas de la boca, epitelio lingual, encías, bandas coronarias, pezones y patas. En bovinos y suinos el VEV es clínicamente indiferenciable de la fiebre aftosa (COTTRAL, 1972).

 Los agentes causales pertenecen al género Vesiculovirus de la familia Rhabdoviridae existiendo dos serotipos principales, New Jersey (NJ) e Indiana (Ind) (COTTON, 1927). El serotipo NJ es el más importante desde el punto de vista económico ya que es el responsable de la mayoría de las epizootias (MASON, 1978).

 Se ha intentado minimizar el impacto negativo que esta enfermedad representa para la ganadería de carne y leche por medio de la inmunización. LAUERMAN y HANSON (1984) publicaron una excelente revisión de las experiencias con vacunas a virus vivo modificado y ARBELAEZ et al. (1982; 1989), CASTAÑEDA (1990), CASTAÑEDA et al. (1982), CORREA (1964), GEARHART et al. (1987), HOLBROOK y GELETA (1958), LAUERMAN et al. (1984), LOBOet al. (1979), ORREGO et al. (1987), RAMOS et al. (1993) y REDELMAN et al. (1989) muestran sus observaciones con inmunobiológicos basados en el virus inactivado. 

Las vacunas a virus vivo modificado contra la estomatitis vesicular presentan varias limitantes entre las que se cuentan su inestabilidad antigénica y corta duración de inmunidad (CASTAÑEDA, 1990; CASTAÑEDA et al., 1982; RAMOS et al, 1993; SUÁREZ y RODRÍGUEZ, 1981), lo cual ha llevado al desarrollo de formulaciones inactivadas preparadas con antígenos obtenidos en cultivos celulares (ARBELAEZ et al., 1982; 1989; CASTAÑEDA, 1990; CASTAÑEDA et al., 1982; GEARHART et al, 1987; LAUERMAN et al., 1984; LOBO et al., 1979; ORREGO et al., 1987; RAMOS et al, 1993 y REDELMAN et al., 1989). 

A pesar de estos antecedentes, hasta el presente, no hay experiencia en América del Sur ni en el resto del mundo en la producción de VEV, en gran escala, para la elaboración de vacunas.

La obtención de grandes volúmenes de antígenos virales a partir de cultivos de monocapas celulares en frascos de Roux o botellas rolantes demanda de una amplia infraestructura, servicios y personal. Además el proceso requiere del tratamiento manual repetido, simultáneo e idéntico de numerosas unidades que se traduce en: 
1) múltiples manipulaciones que incrementan el riesgo de contaminaciones
2) imposibilidad de controlar las condiciones ambientales de cultivo
3) bajos rendimientos 
4) altos costos de producción. Por estos últimos puntos, la tecnología del cultivo celular en suspensión, más sencilla, económica y eficiente, ha sido ampliamente utilizada en muchos laboratorios que se dedican a la producción comercial de vacunas de uso veterinario. 

La multiplicación del VEV en cultivos celulares en suspensión simplificaría en gran medida la elaboración de inmunógenos. Esta idea fue expresada hace más de diez años por SUÁREZ y RODRÍGUEZ (1981) cuando señalaron la perspectiva para su producción en la línea celular originada de riñón de hámster BHK₂₁ C₁₃ (MACPHERSON y STOKER, 1962) adaptada a cultivos en suspensión (CAPSTICK et al., 1962).

 En este sentido, OBREGON (1994) realizó experiencias preliminares sobre la multiplicación de cepas patógenas y atenuadas del VEV en cultivos celulares de BHK₂₁ C₁₃ en suspensión, con volúmenes de 100 a 600 ml, logrando altos títulos serológicos e infecciosos; lo que indicó la posibilidad de utilizar esta tecnología en la elaboración de fórmulas inmunizantes contra esta enfermedad. 

RAMOS et al. (1979) describieron un sistema mixto (monocapasuspensión-monocapa) de cultivos de BHK₂₁ C_13, OBREGON et al (1984) diseñaron, construyeron y pusieron en operación un bioreactor de 12 1 y basados en éste, RAMOS et al. (1985) ensamblaron una planta experimental para la producción de antígenos inactivados con especial énfasis en cepas virales patógenas adaptadas a cultivos celulares en suspensión. 

Este trabajo describe la implementación de un método sencillo de producción de antígenos inactivados del VEV empleando tecnología autóctona que abre la oportunidad de ofrecer una mejor respuesta para el control de la estomatitis vesicular en Venezuela.

MATERIALES  Y MÉTODOS 

Descripción de los vasos de cultivo 

Los cultivos celulares de BHK₂₁ C₁₃ se propagaron en un frasco Schott de 15 1 con adaptaciones que permiten la siembra y cosecha de las suspensiones celulares, así como la inyección y salida de aire, termómetro y toma de muestras (Figura 1).

 Los detalles de construcción y operación del aparato han sido publicados por OBREGON et al. (1984). 

Para este trabajo se construyeron los vasos de cosecha y decantación (Figura 2) basándose en frascos Pyrex, de 20 1 con oliva inferior, el tapón superior N° 12 está atravesado por los siguientes elementos: 

Tubo de entrada, de acero inoxidable de 9 mm de diámetro, con manguera de látex, por el cual se introducen al frasco las cosechas celulares provenientes del aparato bioreactor . 

Tubo de salida, de acero inoxidable de 9 m m de diámetro con manguera de látex, se usa para transferir el cultivo celular decantado y concentrado al vaso de infección. 

Filtro de aire, de algodón hidrófobo, permite el intercambio de gases a la atmósfera. 

La oliva inferior lleva adaptada una manguera para descartar el medio de crecimiento usado cuando se decantan las cosechas celulares contenidas en el frasco. 

Se usó un frasco pyrex de 10 1, fondo plano, con tuberías de entrada y salida de líquidos, inyección y salida de aire filtrada, termómetro, toma de muestras e inoculación (Figura 3). Las especificaciones de construcción han sido descritas por RAMOS et al. (1985).

Medios de cultivo

Se utilizó el medio mínimo esencial de Eagle con 2,95 g/l de caldo triptosa-fosfato, L - Glutamina, aminoácidos esenciales, vitaminas y antibióticos (MME-E) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) como medio de crecimiento (MC). 

El medio de mantenimiento y diluente de virus (MV) consistió en MME- E suplementado con 30% de Tris 0,2 M pH 7,6 y 1% de SFB.

 Los medios de cultivo se esterilizaron por filtración en equipos Millipore en lotes de 20 1, se tomaron muestras para los controles de esterilidad bacteriana y micótica, almacenándose a 4 °C hasta su uso. 

Células y preparación de cultivo madre

Las semillas celulares de BHK₂₁ C₁₃ fueron suministradas por el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Investigaciones Veterinarias. Estas se sembraron con una densidad inicial de 0,5 -0,6 x 10⁶cel / ml en MC con volúmenes de 2,5 -3,0 1 en frascos Pyrex de 8 1 con sifón y barra magnética, se incubaron a 37 °C con agitación (100-200 rpm) por 24 h (RAMOS et al, 1979), realizándose los contajes de viabilidad celular en una cámara de Neubauer con tinción de eosina a l 0,2%. 

Las correcciones de pH se realizaron con una solución de NaHCO₃ al 7,5% y cuando fue necesario, se almacenaron los cultivos a 4 °C.

 Cepas virales y preparación de semillas de producción 

En las experiencias de infección se usaron dos cepas de VEV patógenas provenientes de epitelios bovinos de campo, una serotipo NJ-19553/Bolívar 91 y otra serotipo Ind-20086/Sta. Bárbara 93; éstas se aislaron en monocapas celulares de Vero y se multiplicaron con dos pasajes en botellas rolantes con monocapas de BHK₂₁ C₁₃ adaptadas a suspensión, almacenándose en alícuotas a -70 °C hasta su utilización como semillas virales de producción (OBREGON, 1994).

Tipificación, título serológico e infecciosidad viral 

La tipificación y título serológico de los antígenos virales se realizó por la técnica de FC'₅₀ normalizada por el Centro Panamericano de Fiebre Aftosa (ALONSO FERNÁNDEZ, 1986). 

Las suspensiones virulentas fueron tituladas por inoculación intraperitoneal en ratones lactantes de 5-6 días cepa IVIC, con diluciones décuples seriadas a razón de 6 animales por dilución. El volumen inoculado fue de 0,05 ml, usándose como diluente tampón de fosfatos 0,1 M, pH 7,4 - 7,6. 

El número de animales paralíticos y muertos se observó por 7 días y la dosis letal 50% en ratón lactante (DL₅₀RL) se calculó por el método de REED y MUENCH (1938).

Método de operación 

Se transfiere el cultivo celular madre (2,5 -3,0 1) por el tubo de siembra al bioreactor, a continuación se agrega MC hasta un volumen de 5-6 1, calculando que la suspensión de siembra posea una densidad de 0,6- 0,7 x 106 cel / ml. El aparato se incuba a 37 °C con agitación por barra magnética (100-200 rpm) e inyección de aire por 22-24 h, al cabo de las cuales se toman muestras para determinación de viabilidad celular, estimándose que el cultivo deberá alcanzar una densidad de 1,60 (±0,40) x 106 cel / ml, adicionándose entonces MC hasta el volumen operacional del bioreactor (12 1), continuándose la incubación en las condiciones antes descritas (Figura 4). 

Las suspensiones celulares propagadas en el bioreactor son cosechadas todos los días con volúmenes que usualmente oscilan entre 6- 7 1 y de una concentración promedio de 1,60 x 10⁶ cel/ml, recolectándose en los vasos de cosecha y decantación a razón de dos cosechas por frasco, los ajustes de pH se realizaron con una solución de N_aHCO₃ a 17,5% (Figura 4).

 Opcionalmente se pueden sembrar unas 80 botellas rolantes de 670 cm2 (OBREGON et al., 1984) para obtener monocapas celulares y utilizarlas en la preparación de semillas virales de producción o elaboración de antígeno inactivado.

El bioreactor se mantiene en cultivo semi-continuo agregándole MC hasta un volumen de 12 1, incubándose el aparato en las condiciones indicadas hasta su cosecha final. 

Una vez realizadas las cosechas celulares en los vasos de cosecha y decantación estos son almacenados a 4 °c por 24 h, lo que permite la precipitación por gravedad de las células, procediéndose entonces a desechar el MC usado por la tubería instalada a tal efecto, quedando el sedimento celular en el fondo del frasco (Figura 4). 

El taco celular resultado del procedimiento anterior se resuspende en aproximadamente 1L de MV a 37 °C y es transferido al vaso de infección, donde es inoculado con las semillas de VEV a una multiplicidad de infección de 0,01 -0,05 DL₅₀RL/célula, se coloca a 37 °C con agitación magnética suave por 1 h y luego se le añade MV hasta un volumen que contenga una densidad final de 2,0 -2,5 x 10⁶cel/ml; se incuba a 37 °C con agitación magnética e inyección de aire por 18 -22 h, al cabo de las cuales el efecto citopático es evidente en las poblaciones celulares infectadas que presentan un 80- 90% de mortalidad con densidades promedio de 0,38 (±0,22) x 10⁶ cel/ml. 

El MV conteniendo material viral es cosechado y distribuido en frascos plásticos de 1 L, centrifugados a 2 500 gravedades por 15 min a 4 °C y recolectados los sobrenadantes en frascos Pyrex de 12 1. Estos se almacenan a 4 °C; después de tomar las muestras para tipificación y titulación serológica por FC'₅₀, infecciosidad por DL₅₀RL y esterilidad bacteriana y micótica.

 Una vez conocidos los resultados de las pruebas anteriores, los lotes virales son inactivados con 3 mM de etilenimina binaria por 24 h a 25°C (BAHNEMANN, 1975), tomándose muestras para FC'₅₀, inocuidad en RL y esterilidad, almacenándose a 4 °C hasta su utilización en la formulación de vacunas experimentales contra la estomatitis vesicular . 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN 

El sistema señalado produce aproximadamente 10 x 10¹⁰ células por semana, suficiente para generar unos 40 1 de VEV crudo con títulos infecciosos promedio de 7,38 (±0, 74) log_l0DL₅₀RL/ml. Este nivel de producción hace necesario el procesamiento de 100 1 de medios de cultivo operando en forma continua.

El Cuadro presenta los títulos infecciosos de 24 lotes de VEV, serotipos NJ e Ind, equivalentes a 203 1 de antígenos así Como los títulos serológicos Correspondientes antes y después de inactivar , lo que indica la factibilidad de la producción en gran escala de antígeno vacunal de óptima calidad.

 También se sembraron 241 botellas rolantes con suspensiones celulares que proporcionaron monocapas de BHK_2l C_l3 las cuales una vez infectadas produjeron 22 1 de VEV NJ con títulos infecciosos promedio de 7,22 (±0,66) log₁₀DL₅₀RL/ml y 2,1 l de VEV Ind con títulos de 7,23 (±0,28) log₁₀DL₅₀RL/ml. 

No se observaron diferencias significativas entre los títulos infecciosos de los antígenos obtenidos en monocapas y en suspensión de BHK₂₁ C₁₃, lo cual indica que el ciclo de replicación del VEV es idéntico en ambos métodos de cultivo celular; sin embargo, la producción de antígenos a partir de cultivos celulares de BHK₂₁ C₁₃ en suspensión presenta las ventajas de sencillez, economía y eficiencia con respecto a los cultivos en monocapas.

 El ciclo de replicación del VEV es complicado en la mayoría de la suspensiones virales por la presencia de partículas no infecciosas y autointerferentes. Los cultivos de BHK₂₁ C₁₃ inoculados con una multiplicidad de infección de 0,01 -0,05 de DL₅₀RL/célula alcanzaron los máximos títulos infecciosos entre las 18 -22 h post-infección, menores multiplicidades de infección prolongan el tiempo de incubación y producen antígenos virales de bajos títulos. 

Durante el proceso de infección no se hizo necesario el ajuste de pH, este se mantuvo entre 7,6- 7,9, gracias a la capacidad tampón del Tris en el M V ya la inyección de aire al fondo del cultivo.

 El presente método muestra su aplicabilidad ya que la inversión inicial de capital es bastante baja, si se compara con otros sistemas de producción que posean el mismo rendimiento. Con el equipo básico descrito se estima que es posible producir anualmente unas 250.000 -300.000 dosis de vacunas antiestomatitis vesicular. La cantidad de antígenos producidos se puede incrementar mediante la incorporación de nuevos elementos contemplados en el diseño de la planta de acuerdo a las necesidades de investigación y/o producción de los usuarios.