Veterinaria Tropical 19: 75-82. 1994

ESTUDIO in vitro PARA EVALUAR LA RESPUESTA INMUNE DE PECES DORADOS Carassius auratus A LA VACUNACIÓN CON UNA  BACTERINA A BASE DE Vibrio anguillarum, BIOTIPOS I Y II

Antonia M. Clavijo*, David Conroy* y Aura Gallardo de López*

*FONAIAP centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias Apdo. 70.
 Maracay 2101 Venezuela  Universidad Central de Venezuela
Facultad de Ciencias Veterinarias
Apdo. 4563. Maracay 2101. Venezuela
Recibido: Mayo 01, 1994

RESUMEN

Se realizaron pruebas de fagocitosis para demostrar inmunidad en peces vacunados contra la vibriosis con la bacterina VAB2R. Se utilizaron 60 peces dorados, de los cuales 40 fueron vacunados siguiendo las recomendaciones de la casa productora. La vacuna como promotora de inmunidad exclusivamente contra la cepa de referencia de V. anguillarum biotipo 11, tal como se demostró en el Laboratorio, esta bacterina no es la más adecuada para este medio. En consecuencia, se hace necesario investigaciones que conduzcan a la producción de una vacuna eficaz, mediante la inclusión de cepas autóctonas en su composición.

 INTRODUCCIÓN 

La acuicultura, como una actividad productiva tiene gran importancia en la actualidad por proveer al hombre de peces de aguas continentales y marinas como fuente de proteína animal. 

El rápido desarrollo de la acuicultura ha hecho que se preste mayor atención a las enfermedades, básicamente de origen bacteriano, viral y de otros organismos infectocontagiosos que pueden ser serias limitantes en el desarrollo de estas actividades productivas. Entre estas enfermedades tenemos la vibriosis, la cual figura como la más importante dentro de las afecciones bacterianas que han sido descritas para especies marinas (1, 2,6, 8, 13) y como enfermedad que también tiene importancia en cultivos de aguas dulces (9, 11).

 En Venezuela, varias especies de peces seleccionadas para operaciones acuícolas en aguas costeras, como son el pámpano 
Trachinotus spp., las lisas Mugil curema y el lebranche Mugil lisa han sido afectadas por la vibriosis (1, 5,10). 

La vibriosis es una infección sistemática, distribuida mundialmente, que se caracteriza por un foco local al inicio, seguido de una rápida necrosis de los tejidos a nivel subcutáneo, petequias alrededor de los ojos y boca, así como abscesos y úlceras hemorrágicas que afectan la piel y musculatura. La base de las aletas pueden mostrar eritemas. 

En los órganos internos se observan con frecuencia inflamación y congestión del intestino y ano, petequias en las paredes abdominales internas, congestión del hígado y peritoneo, hinchamiento y necrosis del riñón y esplenomegalia. En algunos peces se observa anemia aguda. A veces se presenta una peritonitis con acumulación de líquido sanguinolento en la cavidad abdominal (7). 

Una vez diagnosticada la vibriosis dentro de una explotación es necesario tomar medidas para controlaría y evitar así cuantiosas pérdidas. Hasta hace poco los medios disponibles para combatir la enfermedad estaban basados en el uso de sustancias químicas y antimicrobianos (3, 18). El tratamiento quimioterápico es el método más comúnmente empleado en el presente, a pesar de que es curativo y no preventivo y de que muchos de los productos utilizados son tóxicos y peligrosos para los humanos. Además, la aplicación de los mismos a peces enfermos es impráctico en la mayoría de los casos debido a que estos animales son muy sensibles a la manipulación, consume mucho tiempo y es una labor que demanda mucha mano de obra. En consecuencia, la vacunación contra enfermedades bacterianas es una práctica que actualmente se está estableciendo en los centros de producción piscícola de Asia, Europa y Norte América. Por medio de la vacunación se consigue inmunidad contra el agente para el cual se ha aplicado el inmunógeno.

 La vacunación, además de provocar protección, tiene la ventaja de no ocasionar problemas de resistencia bacteriana, ni dejar residuos de antimicrobianos en los peces, los cuales puedan llegar al consumidor a través de ellos (12, 15, 17, 18). 

El presente trabajo tuvo como finalidad establecer el grado de protección de una vacuna contra la vibriosis estudiada por la respuesta inmune de células in vitro. Para esto, se procedió a determinar la activación de la fagocitosis que es la reacción de defensa más ampliamente distribuida y que ocurre prácticamente en todos los animales. 

MATERIALES Y MÉTODOS

 Este estudio fue realizado en el Laboratorio de Bacteriología del Instituto de Investigaciones Veterinarias, del Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias en Maracay, estado Aragua. 

Se utilizaron 60 peces dorados, Carassius auratus L., de los cuales 40 fueron vacunados contra la vibriosis, 20 quedaron sin vacunar a fin de servir como grupo control. Los peces presentaban un peso promedio de 15-20 g y fueron colocados en grupos de 10 en acuarios de 10 x 75 x 60 cm los cuales fueron numerados del 0 al 5. Los R ejemplares de los acuarios 2 al 5 se vacunaron con la bacterina VAB2 
(A.V.L. Saffron Walden, Inglaterra) siguiendo las recomendaciones de la casa productora. 

El producto biológico utilizado viene en presentación líquida, de color marrón opaco, preparado con cultivos de Víbrio anguillarum (biotipos 1 y 11) tratados con formalina. El biológico fue diluido al 1: 10 y administrado por inmersión. Se efectuaron pruebas de fagocitosis, la cual es recomendada por Munn, * Manning y Tatner (14) como un indicador eficiente de la inmunidad en peces. Se extrajo sangre de la vena caudal a todos los peces, con la ayuda de una jeringa heparinizada, haciendo un pool de la sangre de los peces de cada acuario.

Para efectuar la prueba de fagocitosis in vitro, se centrifugó la sangre obtenida a fin de separar sus componentes. La capa de leucocitos removidos de cada muestra se colocó en láminas portaobjeto extendiéndola para hacer un frotis. Se les añadió 0,1 mil del vibrio en estudio para cada caso, los cuales fueron tomados de cultivos de 24 horas y con una concentración de 2,1 x 10⁹ bacterias/ml. Las cepas utilizadas fueron V. anguillarum biotipo 1 (78-S- KID), V. anguillarum biotipo II (MSC-75) donadas por el Departamento de Ciencias Biológicas del Politécnico de Plymouth, Inglaterra, como cepas de referencia. También fue utilizada la cepa de V. anguillarum (biotipo 1) número 12 aislada en el país a partir de una epizootia de vibriosis en lisas. 

 Las láminas preparadas se colocaron dentro de cápsulas de Petri, tapadas y dejadas a temperatura ambiente entre 16 y 20 horas. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se procedió al lavado de las láminas con el medio de cultivo de tejido (Eagle), luego al secado al aire y a la fijación en metanol durante cinco minutos para su posterior coloración con Giemsa por 10 minutos, se lavaron y secaron al aire.

Se realizaron tres sangrias; la primera se efectuó antes de la vacunación; la segunda 24 días post-vacunación y la tercera 56 días post-vacunación. Las láminas correspondientes a cada una de ellas fueron examinadas al microscopio con un objetivo de inmersión 100x para lo cual se les colocó un cubreobjeto y una gota de aceite de cedro.

 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 

En la prueba de fagocitosis efectuada antes de vacunar a los peces con la bacterina VAB2^R no se observó respuesta inmune representada por la actuación de macrófago, en ninguno de los grupos estudiados. La prueba efectuada 24 días post-vacunación evidenció una fuerte reacción inmunitaria contra la cepa MSC2-75 y similar reacción fue observada 56 días post-vacunación (Cuadros 1 y 2). Los peces vacunados no mostraron respuesta inmune ante la cepa 78-S-KID ni a la cepa autóctono de V. anguillarum, pero si con la cepa MSC2-75.

La fagocitosis de las bacterias por los neutrofilos impide la invasión de los microorganismos a otros órganos. Miyazaki y Kubota (16) señalaron que por este mecanismo se evitó un brote general de V. vulnificus en las anguilas japonesas vacunadas con una bacterina.

En este ensayo, la bacterina utilizada sólo produjo ininunidad contra la cepa MSC2-75. Esto permite inferir que la bacterina VAB2 R es capaz de evitar casos de vibriosis producidos por cepas de V. anguillarum biotio 11, pues frente a ellas se produce una respuesta inmune en los peces vacunados con dicha bacterina. En consecuencia, esta bacterina no es la más adecuada para este medio, ya que se ha demostrado que el V. anguillarum biotipo 1 es predominante en las epizootias de vibriosis en peces de aguas costeras en Venezuela. 

AGRADECIMIENTO 

Agradecemos al Dr. P. D. Smith (Aquaculture Vaccine Ltd. Saffron Walden, Inglaterra) por proveer la vacuna VAB2 utilizada en este ensayo. A los Drs. C. B. Munn y J. E. Harris (Dpto. de Ciencias Biológicas de la Universidad de Plymouth, Inglaterra) por su ayuda para la aplicación de la técnica de fagocitosis. El primero y segundo autor quieren agradecer al Consejo Británico por hacer posible su visita a Plymouth en relación con el programa de trabajo. 

SUMMARY

 The test of phagocytosis was conducted to evaluate the inmune response of fish vaccinated against vibriosis with the vaccine VAB2^R. For this trial 60 gold fish were used. Fourty fish were vaccinated following the recommendations of the vaccine manufacturar and 20 were kept novaccinated as control. The efficiency of the vaccine as promoter of inmunity against the reference strain V. anguillarum bitoype 11, indicates that vaccinations hased on the tested cornmercial vaccine are not adequate for our environmental conditions. Further research with native freid strains of V anguillarum is neccesary, in order to obtain an effective vaccine against the most common strains of the vibrio present in Venezuela.

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