|
Veterinaria Tropical 11:
43-46. 1986
DIAGNOSTICO DE LA GASTROENTERITIS TRANSMISIBLE DEL CERDO EN TEJIDOS INCLUIDOS EN PARAFINA USANDO INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA M. de Rolo*, C. Marín*, S. de Sífontes*, H. Castaños*, L. de Alvárez* y N. de López* *FONAIAP. Centro Nacional de
Investigaciones Agropecuarias. |
RESUMEN Secciones de intestino delgado (yeyuno e ileón) fueron recolectadas en necropsias de cerdos con sospecha de gastroenteritis transmisible (TGE). Un segmento de cada muestra fue fijado en formol al 10%, incluido posteriormente en parafina y luego cortado a 4µ; la otra parte fue congelada inmediatamente de su recolección en la necropsia, a -20°C, para ser cortada luego a 4µ de espesor. Ambos segmentos fue ron teñidos con suero antivirus de TGE del cerdo, conjugado con fluoresceina, para detectar los antígenos virales presentes en las células epiteliales de la vellosidad atrofiada. De un total de 59 muestras procesadas de intestino de cerdos, 15 resultaron positivas tanto en el material fijado en formol e incluido en parafina, como en el material congelado. La técnica resultó eficiente y tan sensible como la del procesamiento de las muestras congeladas, por tal razón este método puede ser utilizado para diagnosticar TGE cuando sólo se dispone de materiales fijados en formol. INTRODUCCIÓN La técnica de inmunofluorescencia directa (IFD) ha sido ampliamente usada para la localización de antígenos virales en secciones congeladas de intestino delgado de suinos (3) y en cultivos celulares; sin embargo, la misma tiene la limitación de que se necesitan tejidos frescos para su procesamiento. Sternberg (5) describió el método de peroxidasa antiperoxidasa (PAP), en la cual la coloración con inmunoperoxidasa puede realizarse en tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. Por su parte Holscher (2) utilizó inmunoperoxidasa para el diagnóstico de enteritis viral en tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. En este trabajo se describe la aplicación del método de inmunofluorescencia directa (IFD) aplicada al diagnóstico de gastroenteritis transmisible (TGE) en cerdos a partir de muestras de tejidos incluidas en parafina, comparándolo con el resultado obtenido usando muestras congeladas. MATERIALES Y MÉTODOS Las muestras utilizadas provenían de animales con procesos entéricos sospechosos de la enfermedad, la cual ya ha sido reportada en el país (4). Fragmentos de intestino delgado (yeyuno e ileón) fueron fijados en formol al 10% y posteriormente incluidos en parafina; luego se cortaron en microtomo de deslizamiento, marca Forma Scientific, en secciones de 4µ de espesor y colocadas en láminas portaobjetos, para someterlas a un proceso de desparafinación con cuatro cambios de xilol, de 10 minutos cada uno, y de dos pases en etanol absoluto para clarificar; luego se sometieron a tres pases en bufer-fosfato-salino (PBS) pH 7,2. Otro segmento de intestino fresco fue congelado inmediatamente después de su recolección y cortado en criostato, marca Shandon, en secciones de 4µ, y fijadas en acetona a -20°C. Ambos tipos de muestras fueron coloreadas con suero antivirus de TGE conjugado con isotiocianato de fluoresceina (Donado por el Dr. Charles Kanitz, Purdue University, Indiana-EE.UU); luego se lavaron tres veces con PBS ph 7,2 para eliminar el exceso de colorante. Las laminillas se montaron con una mezcla de PBS: glicerol (1:9), realizándose la lectura de las láminas, en la mayoría de los casos, inmediatamente después de su preparación; cuando no se pudo proceder de esta manera, las láminas se guardaron en refrigeración a 4°C hasta el momento de la lectura. La interpretación diagnóstica del preparado se realizó en microscopio de luz marca Leitz Dialux 20 EB, usando objetivo 40 x. RESULTADOS Todas las muestras fueron sometidas a ambos procesos, es decir, procesamiento de cortes de material congelado y cortes en material incluido en parafina. En 15 de las muestras procesadas se detectaron antígenos virales en las células epiteliales de la velocidad atrofiada. Los resultados obtenidos por los dos métodos fueron similares en todas las muestras procesadas, razón por la cual se establece que el método de procesamiento de muestras incluidas en parafina puede ser utilizado para el diagnóstico específico de la enfermedad mediante la IFD. En el caso de las muestras positivas, el "background" o fondo fue un poco mayor en los cortes en parafina que en los cortes de material congelado, sin embargo, se pudo reconocer muy bien la positividad de una muestra con respecto a otra. DISCUSIÓN El método de inmunofluorescencia directa es una técnica muy sensible y específica para la identificación de antígenos virales en tejidos y ha sido ampliamente usada para el diagnóstico de diversas entidades patológicas. Hasta el presente, las reseñas del uso de este método indican que se emplea utilizando cortes de criostato de segmentos de intestino. En este trabajo se propone esta metodología para el diagnóstico rápido y específico de esta entidad patológica en cortes de tejidos fijados en formol al 10% e incluidos en parafina. Holscher, et al. (2) informan sobre el uso de tejidos incluidos en parafina para el diagnóstico de enteritis viral en suinos, utilizando la técnica de inmunoperoxidasa, resultando el método muy eficiente. También se ha utilizado la técnica del complejo Avidina-Biotina-Peroxidasa para demostrar la presencia del virus Sendai, en tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (1). Otro reporte del uso de materiales incluidos en parafina es el presentado por Bundza et al., en 1986 quienes evidenciaron antígeno del virus de la peste de pequeños rumiantes en ovinos afectados por la enfermedad; en este caso se utilizó la técnica de inmunoperoxidasa directa. Los antígenos proteicos no son desnaturalizados como consecuencia de fijación en formol, deshidratación e inclusión en parafina, como se puede evidenciar en los trabajos anteriormente citados (1,2), por lo cual puede recomendarse la utilización de este tipo de materiales para realizar de IFD en el diagnóstico de TGE y otras entidades patológicas. Un aspecto importante a tener en cuenta en el procesamiento de los materiales, es el obtener una buena desparafinación, lo cual redundaría en la eliminación de la interferencia de los restos de parafina en el conjugado y por ende en la puesta en evidencia neta de la reacción fluorescente, cuando se trata de casos positivos. SUMMARY Section of small intestine (jejunum and ileum) were collected at necropsy from suspected transmissible gastroenteritis (TGE) virus infected pigs. From each sample one section was fixed in 10% formalin, embedded in paraffin, and sectioned at 4µ; the another section was frozen at -20°C in the moment of recolection at necropsy and sectioned at 4µ. Both sections were stained with FITC conjugate anti-TGE serum for detection of viral antigens in epithelial cells of atrophied villi.ln this paperwere procesed 59 samples of small intestine of swine, of wich 15 were positive from the sample fixed in formalin as well as from the frozen sample. The technique was found to be as sensitive and efficient as the technique of the frozen sample. This method may be utilizing by diagnosis to TGE when only formalin fixed specimens are available. BIBLIOGRAFÍA 1. HALL.C. H.;WARD.J. M. 1984. Acomparison of the Avidin-Biotin-Peroxidase (PAP) inmuno cytochemical techniques for demostrating sendai virus infection in fixed tissue specimens. Lab. An. Sci. 34 (3): 261-263. 2. HOLSCHER. M. A.; KASSELBERG, A. G.; POWELL, H. S.; WILSON. R.B. 1984. Formalin fixed paraffin embedded tissue. Am. Assn. Veterinary Laboratory Diagnosticians. 27 Annual. Proceedings (EE.UU.). p. 51-58. 3. KONISCHI. S.; BOUKOWSKI, R. A. 1967. Use of fluorescein-labeled antibody of rapid diagnosis of transmissible gastroenteritis in experimentally infected pigs. Am. J. Vet. Res. (EE.UU.). 28: 937-942. 4. MARIN, C.; ROLO de M., LOPEZ. N.; ALVAREZ, L.; CASTAÑOS. H.; SIFONTES, S. 1985. Detección de focos de gastroenteritis transmisible en Venezuela. Veterinaria Tropical (Ven.). 10: 35-42. 5. STERBERGER, L. A. 1979. Inmunocyto chemistry. 2ed. New York, EE.UU. Yohn Willey Sons. |