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Zootecnia Trop., 22(04):387-401. 2004

El diseño cruzado: un diseño para la experimentación con vacas lecheras

Nestor E. Obispo, Yusmary Espinoza y José L. Gil

Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CENIAP), INIA. 
Apartado de correos 4653, Maracay 2101. 



RESUMEN

Un arreglo en secuencias de cuadrados latinos fue evaluado estadísticamente y se demostró que fue eficiente para detectar la presencia de los efectos residuales en la experimentación con vacas lecheras. Con esta finalidad, se simuló la producción de leche de cinco vacas, las cuales se asignaron en este arreglo a tres tratamientos durante tres períodos de 15 días cada uno. En el programa SAS, se desarrollo un programa para evidenciar los efectos residuales, y se ejecutaron tres modelos con el Proc GLM: uno donde se incluyeron todas las fuentes de variación presentes, otro para detectar por lo menos un período con efecto residual, y finalmente un modelo clásico de cuadrado latino que no incluyó la separación de los efectos residuales. La secuencia de cuadrados latinos permitió la separación de los efectos residuales de los tratamientos y el cálculo de las medias corregidas por este efecto.

Palabras clave: Vacas lecheras, diseño cruzado, efecto residual, cuadrados latinos, análisis de varianza.

 The crossover design: a design for the experimentation with milk cows

ABSTRACT

An arrangement in sequences of Latin squares was demonstrated to be statistically efficient to detect the presence of residual effects in the experimentation with milk cows. With this purpose, the milk production of five cows was simulated in the application of three treatments during three periods of 15 days each. A program was generated to estimate the residual effects, and other three to be executed by the Proc GLM of SAS: one for a complete model where all the present sources of variation were included, other to detect at least a period with residual effect, and finally a model similar to a classic Latin Square without taking into account the residual effects. The sequence of Latin squares allowed to detect the residual effects of treatments and the calculation of the least squares means corrected by this effect.

Key words: Milk cows, crossover design, residual effect, Latin squares, analysis of variance.

INTRODUCCIÓN

Existe cierto grado de dificultad en la planificación de experimentos con vacas en producción, particularmente en pequeñas unidades de producción donde es limitado obtener un mínimo adecuado de vacas lo más uniforme posible, tanto en etapa y número de lactancia. Por lo general en los casos donde se obtiene el número adecuado de animales para la experimentación, a veces ocurre que la mayor dificultad se centra en la respuesta productiva de estas, la cual resulta muy variable en el tiempo dependiendo de la fase de la lactancia. Por ejemplo, la producción semanal, después de alcanzarse el máximo de producción diaria, va a mostrar una disminución progresiva en el tiempo, de aproximadamente un 3% con respecto a la semana anterior, siendo esta variación igualmente variable de vaca a vaca. Por tanto, el éxito de obtener una buena información experimental en este caso va a depender mayormente del tipo de diseño experimental que permita separar las diferentes fuentes de variación.

La falta de suficientes unidades experimentales (UE) conjuntamente con la progresiva disminución a lo largo de la lactancia, conlleva a que a veces los tratamientos han de ser aplicados en el tiempo varias veces a la misma UE. Esto igualmente implica que si no se proporciona el tiempo adecuado de descanso entre tratamientos, se pueden presentar los llamados efectos residuales, los cuales enmascaran la respuesta obtenida en el siguiente período de no ser considerados entre las fuentes de variación. A tales efectos, se ha empleado el diseño cuadrado latino (CL) y sus variaciones (Cochran y Cox, 1983; Lucas, 1957; Lucas, 1956).

Sin embargo, en el empleo del CL se asume que no hay efecto residual en el siguiente período, siempre y cuando se aplique un período de descanso entre cada período de tratamiento (Cochran y Cox, 1983). Aunque pudiera ser un diseño aceptable, éste ha de descartarse al considerarse las limitantes anteriores. Cochran et al. (1941) propusieron unos arreglos del diseño CL que permitió la estimación de estos efectos residuales, requiriéndose de que cada uno de los tratamientos en el cuadrado estuviera precedido de otro tratamiento en igual numero de veces, es decir balanceado por el efecto residual (diseño cruzado). Visualizando el ejemplo de tres tratamientos presentado por Lucas (1957) con tres tratamientos A, B y C se construyen las siguientes secuencias:

Secuencia

Periodo

1

2

1

ABC

ABC

2

BCA

CAB

3

CAB

BCA

Se observa que el balance se obtiene con un mínimo de dos cuadrados. Por lo general, se requerirán dos cuadrados si los tratamientos son impares o uno si estos son pares (Williams, 1949). En el diseño balanceado de esta forma, cada tratamiento es precedido con igual frecuencia por cada uno de los otros tratamientos [Una descripción completa de estos arreglos y sus particularidades es presentado por Cochran y Cox (1962) y Lucas (1957)]. Los cuadrados son construidos en la base de que los efectos residuales persisten durante un solo período. Otros diseños han sido demostrado ser eficientes para estimar efectos residuales que persisten por más de dos períodos experimentales (Williams, 1949, 1950).

En el arreglo anterior, la precisión de la estimación de estos residuales ha resultado ser considerablemente menor al compararla con las de los efectos directos de los tratamientos. Esto es atribuido a la falta de replicación suficiente para estas estimaciones y en mayor parte por la falta de ortogonalidad de los efectos residuales, tanto con respecto a las secuencias como con los efectos directos. Lucas (1957) sugirió la inclusión de un extra período de experimentación en el CL, construyendo así un CL balanceado para ambos los efectos principales y residuales. Lucas (1957) describió las características particulares en cuanto a los aspectos de ortogonalidad de este diseño al compararlas con las del CL clásico y destacó que en el extra período, al igual que en el CL clásico, cada tratamiento es precedido por cada otro, pero adicionalmente cada tratamiento es precedido por si mismo, surgiendo así un período de efectos residuales que es ortogonal a los efectos directos. Igualmente, los residuales resultaron ser ortogonales a las secuencias, aunque los efectos directos no son tan ortogonales a los animales; sin embargo, esta falta de ortogonalidad fue expresada como insignificante. La cantidad de replicación de los residuales con respecto a los efectos directos resultó de esta manera ligeramente más grande que en el CL convencional.

El presente trabajo se realizó con el objetivo de ilustrar el uso del diseño cruzado como una alternativa para la corrección del error residual en la experimentación, con el cual no sólo se pueden disponer del uso de pocas UE, sino también discriminar los efectos de las diferentes fuentes de variación que afectan esta clase de experimentación.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para la presente demostración, se simularon los datos de producción lechera, los mismos presentan en el Cuadro 1, organizados por número de la observación, secuencias de cuadrados, vaca, período, tratamiento y producción de leche. En la experimentación se asumen períodos de 15 días, y toma de registros diarios de producción. Los datos fueron analizados en base a tres modelos, utilizando el procedimiento del análisis de la variancia con el modelo linear general (GLM) (SAS, 2004).

En el Cuadro 1 se muestran los datos simulados para este ejercicio comparativo.

Cuadro 1. Datos experimentales simulados de producción de leche (Pr), distribuidos por observación (O), secuencia (S), vaca (V), período (P), tratamiento (T).

Para el Proc GLM del SAS se escribieron tres modelos donde se consideraron las distintas fuentes de variación, entre las cuales se incluyeron o no los efectos residuales: un modelo completo, el que contenía todas las fuentes de variación (Vaca(Sec), interacción SEC*TRAT, residuales), un segundo modelo para detectar por lo menos la presencia de efecto residual en un período, y finalmente un modelo simple de cuadrado latino, el cual sólo incluía los efectos de SEC, VACA(SEC), PERIODO y  TRAT.

Además del análisis de varianza, en los programas ejecutados se solicitó una comparación de medias por la prueba de rango múltiple de la mínima diferencia significativa (LSD), usándose igualmente el subcomando Lines el cual permite la agrupación de las mismas. Adicionalmente se solicito la estimación de las medias corregidas por mínimos cuadrados (LSMEANS) con los cálculos de los correspondientes errores estándar (STDERR) y la probabilidad de la diferencia entre dos medias (PDIFF), la cual usa la prueba de t para las comparaciones. En las estimaciones del LSMEANS del SAS, las medias son ajustadas por las variaciones de los efectos residuales, cuando se observa la significancia correspondiente. Igualmente se realizó un contraste de los residuales en el caso del modelo de un período con residual. En cada modelo se solicitó una estimación de la fuente de error del residual.

Una vez introducidos los datos al SAS (Data A; Input SEC VACA PERIODO TRAT Prod. Leche; Cards; lista del Cuadro 1), se escribió un programa para calcular los efectos residuales en los respectivos modelos (c1, c2 y c3). La generación de estas variables se hace necesaria para su inclusión en el modelo como covariables. Se considera que si una observación no contribuye de forma aditiva en un subsiguiente período, a la covariable se le asigna un valor de 0, en caso contrario el valor de 1.

1. Programa para estimar los residuales:

Proc print data=A;
run;
Data B;
set A;
retain last_TRAT;
c1=0;
c2=0;
c3=0;
if PERIODO ne 1 then do;
if last_TRAT=1 then c1=1;
if last_TRAT=2 then c2=1;
if last_TRAT=3 then c3=1;

end;

2. Programa para el modelo de efectos residuales completo.

Proc GLM Data=B;
class SEC VACA PERIODO TRAT;
model Prod. Leche = SEC VACA(SEC) PERIODO TRAT c1 c2 c3 SEC*TRAT / SS1;

* TEST h=SEC e=VACA(SEC);
Means TRAT /lsd lines;
lsmeans TRAT /stderr tdiff pdiff;

quit;

* TEST h=SEC y e=VACA(SEC), Declara que el término VACA(SEC) debe ser usado como término de error para contrastar la hipótesis acerca de los efectos de SEC dentro del modelo.

3. Programa para el modelo con efectos residuales en por lo menos un período:

Proc GLM Data=B;
class SEC VACA PERIODO TRAT;
model Prod. Leche = SEC VACA(SEC) PERIODO TRAT c1 c2 c3 / SS1;

TEST h=SEC e=VACA(SEC);
contrast 'residual' c1 1 c2 -1 c3 0,
   
                    c1 1 c2  0 c3 -1;
Means TRAT /lsd lines;
lsmeans TRAT /stderr tdiff pdiff;

quit;

4. Programa para un modelo sin efecto residual, Cuadrado Latino simple:

Proc GLM data=B;
class SEC VACA PERIODO TRAT;

model Prod. Leche = SEC VACA(SEC) PERIODO TRAT / SS1;

TEST h=SEC e=VACA(SEC);
Means TRAT /lsd lines;
lsmeans TRAT /stderr tdiff pdiff;

quit;

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Resultados del modelo de efectos residuales completo

La salida de los resultados del SAS nos muestra primeramente un resumen de las clases evaluadas en los modelos:  

Class Level Information  
Class  Levels  Values  

SEC 

6 

1 2 3 4 5 6  

VACA

5

1 2 3 4 5  

PERIODO

3 

1 2 3  

TRAT

3 

1 2 3  

Number of observations  90  

El análisis de la varianza para el modelo completo (ver salida del SAS para el Modelo Completo) nos muestra que éste fue lo suficientemente sensible para discriminar la variabilidad existente entre los tratamientos.  

Modelo completo  

The GLM Procedure  

Dependent Variable: Prod. Leche  
Source    DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F  
Model  41 7859.076436 191.684791 33.60 <.0001  
Error  48 273.851493 5.705239  
Corrected Total 89  8132.927929  

   

R-Square Coeff Var  Root MSE Prod. Leche Mean  
0.966328 11.12870 2.388564  21.46311  

El resultado del análisis de este modelo es luego fraccionado en las diferentes fuentes de variación en el siguiente cuadro de análisis de variancia, el cual fue requerido con el subcomandos SS1, Este es el análisis de varianza discriminado que ha de usarse cuando se trata de un diseño balanceado. Cualquier separación en caso de uno no balanceado, puede ser solicitado al SAS con los subcomandos  SS3 o SS4 en la solución del modelo:

Source DF  Type I SS Mean Square F Value   Pr > F  
SEC *5 803.749062 160.749812 28.18 <.0001
VACA(SEC)  24 1144.609667   47.692069  8.36  <.0001  
PERIODO 2  106.742782 53.371391 9.35 0.0004
TRAT 2 247.271929 123.635964 21.67 <.0001  
c1 1   4256.438017 4256.438017 746.06 <.0001
c2 1 1282.651370 1282.651370 224.82  <.0001  
c3  0 0.000000 

. 

.

.  

SEC*TRAT 6 17.613608

2.935601

0.51

 0.7944  

En esta salida del SAS, se observa la separación de los cuadrados medios del error de cada una de las fuentes de variación del modelo. Con la excepción del residual c3, que se quedo sin grados de libertad y de la interacción SEC*TRAT que no fue significativa, todas las demás variables y covariables del modelo completo resultaron altamente significativas.

La comparación de las medias se realizó en este caso sólo para TRAT según se le solicitó en los comandos respectivos. En la salida del SAS se señalan las medias de producción de leche por la prueba de rango múltiple de la mínima diferencia significativa (LSD). 

The GLM Procedure  

t Tests (LSD) for Prod. Leche  

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.  

Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 48
Error Mean Square 5.705239  
Critical Value of t  2.01063  
Least Significant Difference 1.24  

                                                                      

Means with the same letter are not significantly different.  
t Grouping  Mean N TRAT
A 23.6333 30 1  
B  21.1453 30 2
C 19.6107 30 3

Con el subcomando Lines, se separaron las tres medias de los tratamientos (A, B, C). Es importante acotar que en la prueba LSD se evalúan los pares de media cuyas diferencias, difieren el valor del estadístico de Fisher para los grados de libertad involucrados (Steel y Torrie, 1985). Esta prueba, como ya se explicó, es aplicada después de rechazar en el análisis de la variancia la hipótesis nula.  

Dado que se especificó el término VACA(SEC) como el denominador para estimar la significancia de SEC, SAS produjo el resultado.

Tests of Hypotheses Using the Type I MS for VACA(SEC) as an Error Term  
Source DF Type I SS Mean Square  F Value Pr > F  
SEC 5  803.7490622 160.7498124 3.37  0.0190  

En la estimación de las medias por mínimos cuadrados Milliken y Johnson (1984) han indicado que si cada celda de la matriz tiene al menos una observación, entonces las medias marginales de la población pueden ser estimadas. Las  µi, son estimables a través del subcomando Lsmeans. Particularmente en SAS, aunque estas estimaciones se hacen para datos no balanceados, o cuando se quieren ajustar las medias por los efectos covariables o algún efecto específico, en el presente ejemplo el término de la interacción,  SEC*TRAT, el cual se había incluido en la prueba (Test) como término de error, no resultó significativo (ver ANOVA).

2. Resultados del modelo con al menos un período con efecto residual

Debido a que la interacción  SEC*TRAT resultó no significativa en el modelo anterior, esta se excluyó  en el presente análisis. Puede observarse en este análisis, que con este modelo que se detecta una variabilidad altamente significativa (P<0,0001) que luego se observa discriminada en la salida  para SS1.

Modelo de un periodo residual  

The GLM Procedure

Dependent Variable: Prod. Leche  
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model  35 7841.462827 224.041795 41.51 <.0001  
Error 54 291.465102 5.397502  
Corrected Total 89 8132.927929  

                                                

R-Square Coeff Var  Root MSE Prod._Leche Mean  
0.964162  10.82440 2.323252 21.46311  

              

Source DF  Type I SS Mean Square F Value Pr > F  
SEC 5  803.749062 160.749812 29.78 <.0001  
VACA(SEC) 24 1144.609667 47.692069 8.84 <.0001  
PERIODO 2  106.742782 53.371391 9.89 0.0002  
TRAT  2 247.271929  123.635964  22.91 <.0001  
c1 1 4256.438017 4256.438017  788.59 <.0001  
c2 1 1282.651370  1282.651370   237.64 <.0001  
c3 0 0.000000 . . .  

Se observa que la salida diferenciada de las fuentes de variación en este modelo resulta muy similar a la del modelo completo, sólo que no se incluye la interacción antes descrita.

La salida del contraste solicitado entre los efectos residuales indica que estos fueron diferentes entre los períodos. Esta corrección por efectos residuales es usada para el calculo de las medias corregidas por mínimos cuadrados.

Contrast  DF Contrast SS Mean Square F Value Pr > F  
residual  2 5539.089387 2769.544694 513.12  <.0001  

La prueba de comparación de medias se realizó al igual que en el modelo anterior, usando la prueba de rango múltiple mínima diferencia significativa (LSD):  

t Tests (LSD) for Prod. Leche  

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate.  

Alpha 0.05  
Error Degrees of Freedom 54
Error Mean Square 5.397502  
Critical Value of t  2.00488  
Least Significant Difference 1.2026  

          

Means with the same letter are not significantly different.  

t Grouping  Mean N TRAT
A  23.6333 30 1
B  21.1453  30  2
C 19.6107 30 3  

La estimaciones de las medias por mínimos cuadrados corregidas por el efecto residual y las probabilidades de las diferencias entre tratamientos se muestran:

Least Squares Means  

Prod. Leche   

Standard

LSMEAN  

TRAT  LSMEAN Error Pr > |t| Number  
1  18.7705278 0.4581516 <.0001  1
2 21.2649444    0.4581516  <.0001 2  
3 24.3538611 0.4581516 <.0001  3  

La comparación entre medias según se solicitó con el subcomando PDIFF (prueba de T), se muestra en la siguiente salida. Se observan las probabilidades de las diferencias:  

Least Squares Means for Effect TRAT  
t for H0: LSMean(i)=LSMean(j) / Pr > |t|  
Dependent Variable: Prod._Leche  
i/j 1 3  
1   -3.71932  -8.32507  
0.0005 <.0001  
2 3.719317 -4.60575  
 0.0005  <.0001  
3   8.325068 4.605751  
<.0001 <.0001  

3. Resultados del modelo sin efectos residuales, Cuadrado Latino simple:

A diferencia de los dos modelos anteriores, donde se incluyeron las fuentes residuales, este modelo no se incluyen las covariables de los residuales, es decir se analizan como en el caso de un CL normal, a diferencia de los modelos anteriores, el resultado de este análisis señala que el modelo no fue adecuado para detectar la variabilidad entre tratamientos. Este resultado es esperado, al considerarse que los efectos residuales no fueron separados de la fuente de variación por lo que quedaron enmascarados con los efectos de tratamiento.  

Modelo sin incluir los efectos residuales  
The GLM Procedure

Dependent Variable: Prod. Leche  

Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 33 2302.373440 69.768892 0.67 0.8907  
Error 56 5830.554489 104.117044
Corrected Total 89 8132.927929  

R-Square Coeff Var Root MSE Rend_Leche Mean  
0.283093 47.54099  10.20378 21.46311

              

Source  DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F  
SEC 5 803.749062 160.749812 1.54  0.1911  
VACA(SEC) 24 1144.609667 47.692069 0.46 0.9808
PERIODO 2 106.742782 53.371391 0.51 0.6017  
TRAT 2  247.271929 123.635964 1.19 0.3126  

Al no encontrarse diferencias significativas en el análisis de la varianza, no se hacen más estimaciones. En el presente modelo, es importante destacar, que al no poder separarse las fuentes de variación, el error experimental resultó demasiado grande para que el análisis de la varianza pudieran detectar las diferencias entre los tratamientos. En otras palabras la presencia de los efectos residuales bajo el esquema de este modelo quedan confundidos entre los efectos tratamientos.

En resumen, se evaluaron tres modelos para los datos presentados: en el primero una vez incluidas las distintas fuentes de variación, se evidenció la presencia de los efectos residuales. En este modelo la fuente de variación SEC*TRAT al no resultar significativa no se incluyó en el segundo modelo. En este segundo modelo, las medias fueron ajustadas por las correspondientes covariables (residuales) y se obtuvieron las estimaciones de medias corregidas por este efecto. En el tercer modelo no se incluyeron las estimaciones de los efectos residuales como fuentes de variación con lo cual muy poco se pudo demostrar en la respuesta a los tratamientos, ya que los efectos residuales crearon confusión en el valor de la respuesta.

CONCLUSIONES

En la investigación con vacas lecheras, particularmente en aquellas explotaciones donde se hace difícil la obtención de un grupo suficiente de unidades experimentales, uniformes en el tiempo y número de lactancias, un arreglo en secuencias de cuadrados latinos resulta práctico para revelar el efecto remanente de la aplicación de un tratamiento en el siguiente período, que de no considerarse, pudiera generar efectos confundidos a la hora de interpretar los resultados. Un adecuado diseño experimental permite la reducción en el número de unidades experimentales. En el presente trabajo, con 5 vacas en producción, se logró generar suficiente información para evidenciar diferencias entre los tratamientos aplicados, lográndose balancear ortogonalmente los efectos principales y los residuales al mismo tiempo.

BIBLIOGRAFÍA

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