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Zootecnia Tropical, 17(1) :111-144. 1999


REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

LOS MARCADORES MICROBIANOS Y SUS PERSPECTIVAS PARA ESTIMAR LA PROTEÍNA SINTETIZADA EN EL RUMEN

Néstor E. Obispo

FONAIAP - CENIAP. Instituto de Investigaciones 
Zootécnicas. Maracay 2101. Apartados de correos
 4653. Aragua, Venezuela. Recibido:22-12-1998 
Aceptado:22-02-1999


INTRODUCCIÓN 

Las investigaciones en nutrición con rumiantes han demostrado que los microorganismos del rumen, además de digerir carbohidratos estructurales de los alimentos, son también una fuente importante de proteína para el animal hospedador. La microbiota del rumen es diversa por naturaleza y los individuos ocupan varios nichos (48). Además, estos microorganismos no sólo difieren en el tamaño de sus poblaciones, sino también en su contribución con el hospedero.

A pesar de todo lo qe se conoce sobre la fermentación ruminal, todavía existe la necesidad de estimar la biomasa microbiana cuando investigamos el proceso digestivo global y el valor nutritivo de los alimentos para el ganado. Es muy importante obtener una estimación confiable de la contribución de la proteína microbiana (PM) con el animal hospedador para poder calcular los requerimietos alimenticios bajo condiciones prácticas (6,68).

La estimación del crecimiento microbiano en el rumen y el flujo de su proteína al intestino delgado, es altamente dependiente en un marcador microbiano

confiable. Sin embargo, a pesar de que se han realizado algunos trabajos al respecto, usando por ejemplo: ácido diaminopimélico (49,73), ácido aminoetilfosfónico (4), ácidos nucleicos (5,13,61), ATP (93) y purinas totales (1,90,101) como marcadores internos, y 35S (85) , 15N (34) y 32P (91), como marcadores externos, ninguno de estos componentes celulares o is6topos incorporados, han resultado ser buenos como marcadores.

Para estimar la PM a nivel del duodeno, se requiere de una muestra bacteriana del rumen para la obtención de un estándar, el cual debe ser representativo de la población microbiana. Hasta el presente, no hay información, sobre el contenido total de purinas en cultivos puros de las bacterias del rumen y su relación con los valores obtenidos de las muestras bacterianas mixtas aisladas del rumen. Esta información es primordial antes de que cualquier estimación confiable pueda hacerse acerca de la cantidad de PM que pasa al duodeno.

Marcadores microbianos

Aproximadamente el 80% de los requerimientos diarios de aminoácidos en los rumiantes es proporcionado por las proteínas microbianas que fluyen desde el rumen al intestino delgado (49,50,83,84) . Debido a esa importante contribución del cuerpo de los microbios ruminales con la proteína total del animal, se considera que su cuantificación es fundamental para predecir con exactitud la disponibilidad protéica que va a ser utilizada por el animal.

La digesta que llega al intestino delgado, contiene proteínas derivadas de tres fuentes diferentes, es decir, las proteínas microbianas que se sintetizaron en el rumen, la de los alimentos que han pasado sin ser degradada y la proteína endógena (secreciones del abomaso y células de descamación epitelial). Si un marcador apropiado está presente en una de estas fracciones, entonces del contenido total de proteína, la porción de esa fracción puede ser determinada.

El uso de un marcador microbiano se basa en la premisa de que un componente dado de la célula microbiana es proporcional al número, o al peso de la células pero no su tamaño (31). Cuando los microbios están creciendo, está aumentando el número de células, las cuales se acumulan en centenares, miles o billones de poblaciones o de colonias, donde resulta que la masa total de la población microbiana es aproximadamente proporcional al número de células en esas poblaciones. Por lo anterior se puede deducir que la tasa de aumento en la masa de la población, es a menudo una medida aproximada de su tasa reproductiva.

Un marcador microbiano que se considere ideal debe tener los siguientes atributos:

  • Encontrarse solamente en los microbios (no presente en los alimentos).

  • Ser biológicamente estable, es decir, no ser afectado en el tracto digestivo o por sus microbios.

  • Tener un procedimiento fácil para su determinación, es decir, simple, específico y sensible.
  • Ser un porcentaje constante de la célula intacta en todas las fases de su crecimiento.
  • Todas las formas del marcador deben fluir a una misma tasa, es decir, si esta libre, parcialmente unido a la célula o a una porción celular de una célula rota o dentro de una célula intacta.

Se han usado diferentes marcadores para estimar la contribución microbiana a la proteína total que llega al intestina delgado; sin embargo, debido a algunos errores inherentes en sus metodologías analíticas, su valor ha sido cuestionado. Pudiéndose decir entonces, que hasta la fecha no hay un método adecuado para determinar esta fracción protéica, ya que la validez de esos marcadores microbiano hasta ahora conocidos, ha sido difícil de fundamentar (10, 31,36,87).

Cualquier medida de la PM que sale del rumen se complica aún más por el simple hecho de que por lo menos tres tipos diferentes de microorganismos están involucrados, es decir, bacterias, protozoarios y hongos. La tasa y magnitud del crecimiento de cada uno de estos microorganismos es diferente y es afectado por el volumen total del rumen, tasa de pasaje, tipo de alimento, tasa de consumo y frecuencia de alimentación (44,66) . Mientras el volumen del rumen y la tasa de pasaje pueden ser determinados rápidamente, la tasa de pasaje microbiana resulta confundida por el hecho de que algunos organismos están fuertemente pegados a las partículas sólidas y no fluyen a la misma tasa que la fracción liquida (2, 47). Aunque hay procedimientos confiables para estimar las concentraciones de bacterias, protozoarios y hongos (28,29,30,69), y para medir el recambio de las partículas o de la materia seca (48), no hay en la actualidad un método apropiado para estimar el gran número de microorganismos pegados a esas partículas (11,71). Por lo tanto, para estimar la PM total que alcanza el duodeno se requieren de distintos marcadores para cada uno de estos microorganismos (31).

En la mayoría de los estudios con marcadores, cuando los investigadores se han interesado en medir el pasaje de la PM, la proporción del marcador con respecto al nitrógeno (N2) es determinada en una muestra, de referencia, físicamente aislada del contenido ruminal, de bacterias o de protozoarios, y de la digesta duodenal. La PM es calculada entonces como el producto de N total multiplicado por el factor 6,25. Este factor se origina en la base de que el valor medio de N2 para la mayoría de las proteínas es del 16%. Sin embargo, aproximadamente el 30% del N2 microbiano se encuentra bajo la forma de N2 no proteico en la porción indigestible de la pared de la celular. Igualmente, la verdadera PM contiene aproximadamente 15% de N2, lo que da un factor de corrección de 6,67. Lo anterior conduce generalmente a una significante sobrestimación de las determinaciones (43,92). Adicionalmente, los protozoarios y los hongos parecen contener menos de la mitad de la concentración del nitrógeno por unidad de materia seca que las bacterias (41,52,95). Por consiguiente, si la composición microbiana, es decir, el porcentaje de bacterias, protozoarios y hongos, va a variar marcadamente entre la muestra de referencia, aislada del contenido ruminal, y la población obtenida en el contenido duodenal, entonces un error considerable se introduce en las estimaciones de la PM (31).

Los marcadores usados para estimar la concentración de la PM se pueden diferenciar en dos grandes grupos: los formados por aquellos componentes externos marcados, los cuales son uniformemente incorporados dentro de un nuevos organismos en crecimiento, y aquellos componentes internos, inherentemente presentes en los microorganismos (10,31,84,85). En los Cuadros 1 y 2 Dehority (31) resumió alguno de los marcadores internos y externos más usados, incluyendo un resumen de los mayores inconvenientes que alejan al componente de la condición de marcador ideal.

Los ácidos nucleicos (AN) o las purinas, los ácidos diaminopimélico (ADAP) y aminoetilfosfónico (AAEP), D-alanina y el perfil general de aminoácidos de la digesta están entre los marcadores internos más ampliamente usados. Sin embargo algunos de estos componentes químicos se han encontrado distribuidos desigualmente entre las células, bacterianas y protozoarios, así como también, han sido encontrados en el alimento. Adicionalmente, AAEF, ADAP y D-alanine, están principalmente asociados con las paredes celulares, éstas suelen ser más resistentes a la digestión que el contenido celular; por consiguiente la digesta se encuentra enriquecida con estos componente de la célula lo que puede ocasionar una subestimación de la salida de la masa microbiana (72).

Cuadro 1. Marcadores internos usados para estimar concentraciones de los microbios y de proteína1.

Para los marcadores externos hay desventajas adicionales, es decir, el uso de los isótopos 15N o 35S involucro procedimientos de análisis un tanto complicados y costosos (10,85). También, los trazadores radiactivos (35S o 32P ) requieren de la toma de precauciones adicionales, cuando se trata de su uso en ensayos con animales (31).

Cuadro 2. Marcadores externos para estimar las concentraciones de los microbios y de proteína1


Marcador Fracción microbiana Principales desviaciones
del marcador ideal
Referencias

15N Bacterias y protozoarios Los grupos de bacterias no son igualmente enriquecidos 34
35S Bacterias y No todos los aminoácidos   azufrados se originan de sulfatos o sulfitos 39,85
32P Bacterias y protozoarios La composición celular cambia durante el crecimiento microbiano 91

1Fuente: Dehority (1995)

Dehority (31) ha señalado que en la mayoría de los trabajos que involucran el uso de marcadores para estimar el crecimiento microbiano, los hongos anaeróbicos se han ignorado casi por completo. Al respecto, Orpin (70) usó la quitina como marcador fúngico; sin embargo, supuso un porcentaje constante de este compuesto en los hongos, sin tener en cuenta edad, especie involucrada, o el estado fisiológico de estos microorganismos. Mas tarde, aunque ninguna comprobación de la metodología ha sido reportada, Akin (3) y Gay et al. (40), usaron procedimientos enzimáticos, quitinasa y quitina sintetasa, para estimar la biomasa fungal y el contenido de proteínas en cultivos de hongos, respectivamente.

Debido a la variación dentro y entre microorganismos el uso de marcadores microbianos ha demostrado ser insatisfactorio. No obstante, Broderick y Merchen (10) propusieron el uso del método de las purinas totales. Este idea fue evaluada críticamente por Stern et al. (84), quienes proponen el uso de las purinas a del 15N como marcadores microbianos para estimar la concentración de la proteína en la digesta. Sin embargo, ellos sugirieron a su vez, la realización de más investigación a fin de determinar cuál de estos marcadores pudiera ser el más confiable.

Los ácidos nueleicos en el estómago del rumiante

Gaussères y Fauconeau (38) desarrollaron un método para cuantificar los AN en el alimento, contenidos digestivos y en los microorganismos, usando una proporción de adenina más guanina y medida desde ácido desoxirribonucleico (ADN) con respecto al nitrógeno total. Sin embargo, su procedimiento fue criticado porque la metodología involucraba una separación muy tediosa de las bases y de otros productos de la ruptura de los ácidos nucleicos. Ellos compararon la composición del contenido ruminal, microbios del rumen y alimentos, concluyendo que la mayor parte del ADN del contenido ruminal era de origen microbiano. Igualmente, Temler-Kucharski y Gausséres (86) observaron que entre el 50 y 70% del N, total y proteico del contenido duodenal era de origen microbiano, cuando fue derivado como lisina y ADN contenido en el alimento.

Ellis y Pfander (33) encontraron que entre el 13,8 y 18,4% del nitrógeno microbiano era proveniente de los ácidos nucleicos. Observaron igualmente, altas correlaciones entre los AN totales (r=0,80) y el ácido ribonucleico(ARN) (r=0,72) con respecto al N2 microbiano total. El ARN y ADN se incremento en muestras de fluido ruminal incubadas in vitro y que estos AN juntos representaron cerca del 15% del nitrógeno microbiano formado.

Smith y Mcallan (80) trabajando con becerros, alimentados con diferentes dietas y sin considerar la variación entre los terneros, e independiente de la cantidad de N, en la dieta, reportaron una fuerte correlación entre la concentración de nitrógeno de los AN (N2-AN) y el N2 total en las muestras de fluido ruminal. La proporción N2-AN:N2 total se encontró oscilar en el rango de 9,5 a 15,5%.

El material vegetal que entra al rumen, contiene cantidades significativas de AN, y su concentración varía considerablemente con el tipo de planta (23) . McAllan y Smith (60) indicaron que la cantidad de AN en muestras de fluido del rumen siempre resultaron más altas (por lo menos cinco veces más) de lo que puede ser explicado por los niveles de estos compuestos consumidos en la dieta. Cuando se adicionaron el ARN y ADN puros, tanto al rumen o al fluido ruminal incubado in vitro, ellos fueron rápidamente degradados y sólo el 10% permaneció después de 45 min. de incubación. Fue razonado, que el AN dietético probablemente duraba sin ser degradado en el rumen mientras estuviese protegido dentro de las estructura celulares y que aquéllos encontrados en el licor ruminal eran principalmente de origen microbiano. Esta idea fue apoyada por el hecho, de que a pesar de las diferencias en las proporciones de ARN:ADN de la dieta, estas variaciones no eran evidentes en las muestras de fluido ruminal tomadas corto tiempo después del consumo del alimento (60,80,81).

Leedle et al. (55) , investigaron las variaciones diurnas en el peso seco y composición de bacterias del contenido ruminal y observaron que los constituyentes celulares dentro de la población bacteriana muestran muy poca variación diurna. Los niveles de ADN variaron entre 1 y 2% del peso seco, los niveles de ARN resultaron ser 10 veces más altos que los niveles del ADN, con los valores de ARN más altos encontrados 2 h después de alimentación, lo que se corresponde con el periodo esperado de máximo crecimiento bacteriano. En este estudio, la proteína y el contenido de carbohidratos representaron aproximadamente el 40 y 10% del peso seco, respectivamente.

Smith y McAllan (79) presentaron evidencia de una rápida degradación de AN puro que fue agregada al rumen; sin embargo, ellos advierten de la posibilidad de que algún AN dietético pudiera aportar una apreciable contribución al AN del fluido ruminal, cuando la fuente dietética este protegida por estructuras celulares resistentes a la degradación o al procesamiento. Algunos alimentos contienen niveles mucho más bajos de purinas que los microorganismos del rumen; pero otros, como la harina de pescado, contienen proporciones de purinas totales. N2 total parecidas a la de los microbios del rumen (10) . Subsecuentemente, ya que cantidades significativas de materiales dietéticos escapan a menudo la degradación ruminal, es probable que algún AN, asociado con esas fracciones dietéticas no degradadas contribuyan con el contenido de AN de la digesta duodenal (56).

McAllan y Smith (62) trabajando con fluido ruminal libre de células, observaron que la degradación inicial de AN en el rumen ocurre a través de la acción de nucleasas, las cuales, aunque de origen microbiano, son extracelulares. La ausencia de nucleótidos, nucleósidos y de bases púricas y pirimidinicas, y la posible presencia de cantidades pequeñas de mononucleótidos de pirimidina entre los productos formados por estas enzimas extracelulares, indican que esas ribonucleasas y deoxyribonucleasas son endonucleasas. En ese mismo estudio, las bases púricas y pirimídicas fueron lo bastante resistentes a la degradación in vitro, mientras que sólo cantidades trazas del AN agregado, o sus derivados fueron observados en el fluido ruminal. Se encontró

que las muestras de digesta duodenal contentan xantina, hipoxantina, uracilo, pirimidina, mono y oligonucleótidos y timina. Las bases xantina, hipoxantina, uracilo y timina, parecieron ser relativamente resistentes a la degradación microbiana en el rumen. Sin embargo, aunque no se descubrió guanina, adenina o citosina en el contenido ruminal, cuando AN puros fueron adicionados, ciertas cantidades de adenina dietética y pequeftas de citosina han sido reportadas fluyendo fuera del rumen (77).

Cotta (24) desarrolló cultivos puros de bacterias ruminales, en medios purificados conteniendo ARN, ADN, ribosa, desoxirribosa, adenosina, guanosina, uridina o citidina, y encontrando que Selenomonas ruminantiun HD4, GA192 y D, pudieran usar el ARN para su crecimiento, pero no el ADN. Prevotella ruminicola D13d creció en nucleósidos pero no en las bases libres o en ribosa. Cepas de S. ruminantium fue capaz de usar nucleósidos o ribosa para su crecimiento, pero no así las bases. Cepas de Selenomonas, pero no Prevotella, fueron capaces de usar nucleósidos como fuentes de N2. La producción de nucleasas extracelulares, involucradas en la ruptura del ADN, ha sido reportada por Plint y Thomson (35) en P. ruminicola, F. succinogenes, S. ruminantíum y L. rnultiparus.

Los protozoarios por su parte, pueden contribuir con cantidades significativas de proteína a la PM total producida en el rumen (21), sin embargo, su contribución al N2 microbiano total de digesta duodenal no ha sido bien definida (98) . La contribución de la proteína de los protozoarios al animal hospedero es todavía controversias, principalmente porque no hay un marcador adecuado para los protozoarios. Solamente se han conseguido evidencias indirectas, ya que ellos son difíciles de aislar y mantener en cultivos puros (76) . Ling y Buttery (56), usando los valores de ARN y ADN, observaron considerable variación entre la proporción N2-ARN:N2 total para las bacterias y protozoarios. En ese trabajo, las diferencias no se relacionaron al animal, dietas o periodo de muestreo. Las grandes diferencias se observaron para las proporciones de N-ADN:N total (mg/g) para las bacterias (30,9 ± 3,8) y protozoarios (4,3±0,09) . Czerkawski (27) trabajando con cultivos bien "limpios" de fluido ruminal de protozoarios y bacterias encontró que la proporción de AN:proteína de los protozoarios fue el 96% del de las bacterias, lo que representó una diferencia muy pequeña entre estos dos tipos de microorganismos. Los valores de ARN:N2 total en cultivos mixtos de protozoarios son por lo general relativamente más bajos que aquéllos de los cultivos mixtos de bacterias (56).

Coleman (20,22) observó que el Entodinium caudatum fue capaz de incorporar adenina, guanina y uracilo dentro de la célula. Varias investigaciones (17,18,19) indican que los protozoarios son usuarios activos de AN bacteriano. Por consiguiente, la ingestión de células bacterianas se vuelve una fuente importante de estos compuestos para éstos. Existe muy poca información sobre la utilización de AN por los entodinios, pero nada se conoce respecto al metabolismo de los AN por parte de los holotrícos (23).

Aunque consistentemente baja, la proporción de los AN con respecto al N2 total que alcanza el duodeno se ha observado ir paralela a la encontrada en el licor ruminal. Las diferencias se han atribuido al Nitrógeno que es adicionado por las secreciones del abamaso, mayormente porque no ocurre una degradación significativa de estos AN en el abomaso (79).

McAllan y Smith (1973) observan que los productos ultrafiltrables, formados en la degradación de los AN en el rumen, desaparecen mucho más rápido de la que podría ser considerado fluyan por la digesta. Koenig [citado por Schelling et al.(76)] observó que excepto a las 3h después de alimentación, cuando se observaron bajas cantidades, hubo un sobrepaso despreciable de los AN de la alfalfa con la digesta.

Aunque es cuestionable (25,78,85), generalmente se acepta que la composición química, o las proporciones del marcador microbiano, son similares en el fluido y en las bacterias asociadas a las partículas. Basados en esta asunción, la mayoría del material coleccionado como muestra representativa de los microorganismos del rumen, generalmente se obtiene de la fracción líquida del contenido ruminal, después de varios centrifugaciones diferenciales; por consiguiente, la mayoría de los protozoarios, bacterias grandes, las bacterias fuertemente agrupadas y las bacterias que permanecen firmemente pegadas a las partículas alimenticias, pueden no quedar incluidas en el estándar (94).

Ya que una proporción significativa de las bacterias en el rumen está estrechamente asociada con la fracción sólida (13,15,25,29), el aislamiento de las células microbianas del rumen o de la digesta duodenal, resulta uno de los aspectos más difíciles de la estimación de las proteínas microbianas, y este problema es común para todos los métodos de marcadores microbianos (85).

En cultivos puros, el ADN tiende a reflejar el número de organismos presentes, independientemente de su fase de crecimiento; mientras que cuando consideramos la cantidad de ARN, está es más asociada con la síntesis proteica (61). La proporción ADN:N2 total varía notablemente entre los diferentes organismos y particularmente entre las bacterias y los protozoarios (61) . Originalmente se consideraba que los cambios en la composición microbiana y la fase de crecimiento eran responsables de los cambios en la proporción ADN:N, total; sin embargo, Bates et al. (7) trabajando con cultivos puros de bacterias ruminales ín vitro y con bacterias ruminal mixtas ín vitro, y usando las proporciones de AN:proteína, encontraron que las proporciones de ADN:proteína fueron independientes de la tasa de crecimiento ín vitro. Las proporciones de ARN:proteína eran afectadas por la tasa de crecimiento bacteriana ín vitro, y por la dieta y tiempo después

de alimentar in vitro. La proporción de ADN:proteína se sugirió corno el mejor marcador para la biomasa microbiana para los estudios de pasaje de la digesta (7, 99) . Arambel et al. (5) observaron que la proporción ADN:N2 total (mg/g) en las bacterias disminuía de 27,2 a 20,09, para el ganado alimentado con dietas bajas o altas en concentrados, respectivamente. En la misma investigación, usando cultivos puros de bacterias ruminales, encontraron que la proporción N2-ADN'N2 total (mg/g) difirió entre los organismos Grampositivos (8,8) y los negativos (18,9). Sin embargo, las proporciones N2-ARN:N2 total fueron similares entre estos dos grupo de bacterias.

Debido a que el ARN parecía estar en una proporción más constante con respecto al N2 microbiano total, se consideraba por consiguiente que era un marcador mucho más fiable que ADN o ácido nucleicos totales para estimar la PM. Cuando el valor promedio de la proporción ARN:N2 total los microorganismos ruminales se comparó con los valores promedios de esta proporción en muestras de digesta de becerros, fue estimado que aproximadamente entre el 70 y 60%, del nitrógeno del N2 no amoniacal en los contenidos ruminales y digesta duodenal eran de origen microbiano (61) . McAllan y Smith (64) determinaron que el flujo de N, al abomaso o al duodeno usando ADAP o ARN como marcadores. Los resultados con ADAP fueron más inconsistentes y significativamente más bajos (en aproximadamente 25%) que aquéllos basados en el ARN; sin embargo, ambos dieron patrones relativamente similares, cuando se compararon los diferentes tratamientos dietéticos. Usando la proporción ARN:proteína, Bates et al. (7) encontraron diferencias en la composición de las bacterias libres y en las asociadas a las partículas. La proporción promedio de ARN:proteína para las bacterias libres fue mucho más alta (0, 33) que la de las bacterias pegadas a las partículas (0,20) . Merry y McAllan (67) encuentran que las proporciones N2-ARN:N2 total y N2-ADP:N2 total, fueron significativamente más bajas en las bacterias asociadas a las partículas que en las encontradas libres en el licor ruminal.

De ácidos nucleicos a purinas

Tempranamente McDonald (65) realizó frustados intentos para estimar los AN en la digesta de los rumiantes, preparaciones de bacterias y protozoarios, hojas de plantas y otros alimentos. Utilizó el usó alguno de los procedimientos disponibles para medir los ácidos nucleicos y desarrolló un procedimiento que permitió la determinación de las bases adenina y guanina, usando hidrolisis ácida, seguida por precipitación de las purinas como sales de plata; luego la separación de las bases por cromatografía de papel, y su estimación final por espectrofotometría. Este procedimiento mostró un coeficiente de variación muy bajo (2-6%).

Aunque se utilizaron diversos procedimientos para cuantificar los AN en tejidos de animales, raramente se usaron para estimarles en la digesta del rumen. Ellis y Pfander (33) desarrollaron un procedimiento para estimar los AN usando el contenido de fósforo en ADN y ARN asumiendo una proporción de P:N, de 8:15,3. Por otro lado, usando un método simple para la precipitación y la extracción, Topps y Elliot (89) midieron la concentración de AN en el fluido ruminal, aunque el procedimiento presentó algunas dificultades, principalmente las asociadas con la presencia de materiales de interferencia (61).

Como se mencionó antes, Gaussères y Fauconneau (38) desarrollaron un procedimiento para separar ARN y ADN en una muestra. La muestra se sujetó a tres procesos de extracción en la que estaba envuelto el etanol, el ácido tricloroacetico y una mezcla de metanol-cloroformo. A partir de esos residuos, después de ser hidrolizados en hidroxido de sodio, el ARN fue determinado por la separación fraccionario de sus mononucle6tidos, y del ADN por cromatografía de sus bases púricas. Este procedimiento se criticó por ser consumidor de tiempo y poco satisfactorio para su uso rutinario (61).

Después de una extensa investigación, McAllan y Smith (61) desarrollan un procedimiento para medir ADN y ARN en muestras de digesta. El método involucro varios pasos para la extracción e hidrolísis con soluciones de ácidos e hidroxidos, seguido por ensayos colorimétricos específicos para las pentosas y ácidos nucleicos (es decir, las reacciones de difenilalanina y las del orcinol para el ADN y ARN, respectivamente) . No sólo era estos métodos largos y laboriosos, sino que les faltaba también exactitud y precisión (90, 100,101).

Koenig et al.(54) usando cromatografía liquida de alta presión presión (HPLC) midieron las concentraciones de purinas y pirimidinas, en cultivos de bacterias ruminales mixtas in vitro, como indicadores de biomasa. Individualmente las bases fueron correlacionadas con la PM durante las fases de crecimiento y de muerte. Los coeficientes respectivos de esas correlaciones fueron: uracilo y xantina, 0,9959; 0,9829; timina 0,9837, 0,9218; hipoxantina, 0,9878; 0,6562; guanina, 0,9964; 0,9744; citosina, 0,9987; 0,9255; y adenina 0,9986; 0,9753. Los autores concluyeron que estos altos coeficientes de correlación eran una indicación del uso potencial de ciertas bases como marcadores microbianos.

Jackson [citado por en Zinn y owens (100,101)], verificaron el procedimiento oxidativo de Marshak y Vogel (58), lo que permitió la medición de las bases plaricas y pirimidinicas sin aislamiento previo del AN y sin la presencia de los compuestos de interferencia. No sólo recuperaron cuantitativamente las bases, las cuales permanecieron estables bajo la acción hidrolítica, sino que la metodología fue relativamente más rápida en comparación con los otros procedimientos. El único inconveniente del experimento de Jackson fue, en su momento, lo costoso del análisis por HPLC (100, 101).

Zinn y Owens (100) finalmente proponen un procedimiento analítico para cuantificar las bases púricas en el alimento y en la digesta. Su procedimiento consistió en una combinación de. hidrolísis de la muestra en ácido perclorico para liberar las bases (58) y separación, por precipitación con nitrato de plata en solución ácida, de las bases liberadas de los compuestos de interferencia (53) . Las purinas eran luego solubilizadas y cuantificadas por espectrofotometría. Después, Ushida et al. (90) modifican el procedimiento, incluyéndole un paso de filtración después de la hidrolísis de la muestra, usando luego el procedimiento para medir flujo de nitrógeno microbiano al duodeno en rumiantes. Los autores no sólo evaluaron la exactitud del método comparando los resultados con aquéllos determinado por HPLC, sino que también los compararon con las estimaciones realizadas con otros marcadores (ADAP e incorporación de 35S) . Los resultados del método espectrofotométrico fueron comparables con aquéllos medidos por HPLC. Las recuperaciones de las purinas oscilaron en el rango de 90 al 101%. Al usar ovejas desfaunadas, no se encontron diferencias en el flujo de nitrógeno microbiano al duodeno de estos valores obtenidos con respecto a los obtenidos usando los otros marcadores.

Por otra parte, Berchielli et al.(8), midiendo el flujo de nitrógeno microbiano al duodeno, encuentraron que los valores del ADAP eran más altos (73,2%) cuando los compararon con los obtenidos con 35S (55, 61) o con las purinas (51,1%) . También, Berchielli et al. (9) midieron la eficiencia de la síntesis microbiana en novillos castrados, usando ADAP, purinas y "S como marcadores microbianos. Los valores estimados por las purinas y 35S no fueron significativamente diferentes, pero estos dos métodos si lo fueron con respecto al ADAP. Igualmente, ILLg y Stern (51) encontraron que las purinas totales, como un marcador microbiano, era un mejor estimador de la PM, menos complicado y más económico, que el procedimiento del ADAP.

Luego, Zinn y Owens (101) publicaron más detalles sobre su procedimiento,senalando que la mayoría de los materiales que causaban las interferencias en las estimaciones de AN habían sido removidos. Un promedio de recuperación del 98% de las purinas de fue obtenido cuando el ARN, extraido de las levadura fue hidrolizado sólo o con caseína, almidón de maíz o "solka floc". Los autores señalaron que debido a que las purinas están presentes en el ARN y ADN, la proporción de purina:N, debía ser más constante que la proporción de ARN:N2

Aunque en menor magnitud, el análisis del purine en el contenido duodenal padece de algunos inconvenientes, los cuales afectan las estimaciones de AN. Por ejemplo, las purinas adicionales de origen dietético y las de las celulas epiteliales descarnadas podrían aumentar la posibilidad de sobrestimación de las purinas de origen microbiano. Algunas bases libres de purinas se hablan observado en muestras de contenido abomasal (42); sin embargo, tal parece que esas purinas son metabolizadas rápidamente por los microorganismos ruminales (77). Calsamiglia et al. (12), encontraron que las purinas dietéticas fueron degradados casi completamente por microbios del rumen in vitro. La degradación microbiana del N2 de las purinas del alimento se situó en una rango del 81 al 110% de la cantidad del N2 púrico consumido. En este estudio se concluyó que la contaminación por purinas dietéticas era un factor que afectaba muy poco al N2 bacteriano fluyendo al duodeno.

El congelamiento de las muestras de fluido del ruminal antes del aislamiento de bacterias, puede producir pérdidas de ARN alterarando las estimaciones del N2 bacteriano que fluye al duodeno (13,42,63) . Sin embargo, el contenido de purinas, o la proporción de N2:purinas de las bacterias mixtas no es afectada por los procesos de congelación y descongelación de la muestra, antes de la separacion bacteriana, o por la presencia de algunas enzimas presentes naturalmente (13,42) . Algunos aspectos relacionados a la estructura de la membrana de las bacterias Gram-negativas, más que de las Gram-positivas, se han relacionaron con las pérdidas de AN durante el almacenamiento por congelamiento (46). McAllan y Smith (63) postularon que el efecto físico de congelar y descongelar no sólo podía romper las células bacterianas, sino también liberar algunas nucleasas bacterianas. Este último aspecto fue apoyado por el hecho de que no se observó ninguna pérdida significativa de ARN en los contenidos abomasales congelados donde el pH fue alrededor de 2,5. Así, el bajo pH abomasal inactivaría a las nucleases bacteriana, las cuales tienen una actividad óptima a valores de pH similares a los encontrados en el rumen en condiciones normales.

En diversas investigaciones (13,34,67,96) se ha encontrado que la composicion de las bacterias asociadas al fluido (BAF) y a partículas (BAP) o en las poblaciones mixtas, son diferentes. Cecava et al. (13), usando la proporción de purinas:N,, observaron que éstas en las BAF dieron estimaciones aritméticas más bajas del flujo de N, al duodeno cuando se compararon con las estimaciones para BAP o con los fracciones bacterianas mixtos. Firkins et al. (34) observan que a pesar de que la materia orgánica y N, tendieron a ser más altos para BAP que con BAF, las proporciones de purina:N, fueron similares entre BAP y BAF. Se observaron valores más bajos en esta proporción para los protozoarios (55,4% del de BAF). En el mismo estudio, la contribución del N2 de los protozoarios al nitrogeno no amoniacal en la digesta del duodeno fue considerada ser apreciable (27%).


CONCLUSIONES


Por las fallas metodológicas, las estimaciones de la PM que alcanza el intestino delgado en los rumiantes es hasta la fecha altamente controversias. Estas evaluaciones necesitan un marcador ideal que sea capaz de discriminar los cambios de la biomasa en las distintas poblaciones microbianas en todas sus etapas de crecimiento en el ecosistema ruminal. Con fallas, el procedimiento de purinas totales parece prometedor; sin embargo, se requiere más investigación en este campo por la perentoria necesidad de estimar, de manera más exacta, los planes de alimentación de los rumiantes.


RESUMEN

Basados en la gran contribución de la proteína bacteriana del rumen a la nutrición del animal hospedero, se hace necesario tener un método para medir este criterio. Sin embargo, la exactitud de la estimación de la PM que pasa a través del tracto gastrointestinal es dependiente en un marcador apropiado. En la actualidad, se han utilizado varios marcadores microbianos para evaluar esta producción microbiana, pero defectos básicos en ellos han descartado su aceptación. Aunque no se reuna todo el criterio de un marcador mícrobiano ideal, el procedimiento para medir purinas totales parece prometedor. Este procedimeinto es simple, sensible, preciso y relativamente razonable en el costo. Es de esperar que cambios en la biomasa bacteriana deban asociarse con el número de las celulas microbianas; sin embargo, la información en esta área es sumamente limitada. Por otro lado no existe información disponible sobre el contenido de purinas totales en cultivos puros de bacterias rumiales. 

Palabras Clave: Marcadores microbianos, Síntesis protéica, Rumen, Purinas, Bacterias, Protozoarios.

THE MICROBIAL MARKERS AND THEIR PERSPECTIVES ESTIMATE THE PROTEIN SYNTHESIZED IN THE RUMEN

SUMMARY

Based on the large contribution that bacterial protein can make to the nutrition of the host animal, It is desirable to have a method for measuring this criteria. However, the accuracy of estimating microbial protein passage through the gastrointestinal tract is dependent on an appropriate marker. At present, severas microbial markers have been used to assess bacterial production in the rumen, but basic defects have ruled out their acceptability. Although all the criteria of an ideal microbial marker are not met, the procedure for measuring total purines appears promising. This procedure is simple, sensitiva, precise and relatively reasonable in cost. It is expected that changes in bacterial biomass should be associated with changes in microbial counts; however, information in this area is extremely limited. Also, no information is available about total purine content in pure cultures of rumen bacteria.

Key word: Microbial markers, Protein synthesis,Rumen, Purines, Bacteria, Protozoa.

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