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Vol.  13(1):95-104 Zootecnia Trop.,1995 

DETERMINACIÓN DE LA MASA ESTRUCTURAL DE PROTEÍNAS EN PECES, USANDO MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION

Alicia Arias de Díaz

FONAIAP. Centro de investigaciones agropecuarias y 
pesquera del estado Sucre. Cumaná.
Recibido: 16-05-1994
Aceptado: 03-10-1994


INTRODUCCIÓN

La mayoría de las células y organismos vivientes efectúan procesos metabólicos básicos muy similares, ya que algunos de sus compuestos, estructuras y reacciones son idénticas. Según Dayhoff (5), muchos experimentos han demostrado que estas características son comunes. En los procesos de síntesis y degradación de la mayoría de las células, las proteínas, carbohidratos y nucleótidos exhiben reacciones parecidas; de esta manera usan su energía de manera similar. La mayoría de las reacciones metabólicas son dirigidas por biocatalizadores denominados enzimas. A pesar de que en la mayoría de los organismos vivos, las enzimas homólogas o isoenzimas presentan secuencias de aminoácidos y estructuras tridimensionales muy similares; también pueden reflejar diferencias en su estructura fina, cuya base genética puede ser modificada independientemente de factores ambientales (9).

Tanto los peces marinos como continentales, no escapan a estas características y las proteínas más estudiadas en estas especies son las musculares, plasma, suero y la hemoglobina. Estos estudios han sido efectuados con el propósito de medir variaciones fisiológicas entre especies y géneros, incluyendo las de naturaleza bioquímica, encontrando que en los tejidos, fluídos tisulares y sangre, existen diferencias en estas proteínas. Los métodos más usados para estas determinaciones proteínicas, son la Electroforesis y Cromatografía de Capa Fina; y se ha podido demostrar que existe como mínimo, una proteína específica para cada especie de pez, es decir, existe un código genético único para cada función proteica que le da la especifidad a la especie y como hay miles de proteínas de incomparable talla, energía, estructura y funcionabilidad, parece increíble que los diferentes organismos sean capaces de seleccionar la proteína que los identifique (8).

Desde el punto de vista comercial, los métodos existentes para la identificación de especies de peces basados en sus características morfológicas no pueden ser aplicados a los productos derivados, tales como conservas, filetes, pastas, embutidos y otros, por lo que diferentes técnicas electroforéticas han sido utilizadas para la caracterización o identificación de peces por comparación de sus proteínas musculares.

Los estudios de Levy et al ( 7 ) y Díaz ( 4 ), demostraron que existen moléculas que son características en cada especie en particular, es decir, ellas son la expresión genética de esa especie.

La espectrometría de masa por rayos láser ( Matrix-Assisted Laser Desorption, MALD-MS), es un nuevo método para la caracterización de mezclas complejas de origen biológico, ( Beavis y Chait , 2 ; Colter, 3 ), y es usado para una rápida y segura identificación de la estructura molecular de las proteínas (6,10).

La determinación de las estructuras moleculares de las proteínas musculares en peces, utilizando la técnica MALD-MS no ha sido reportada en la literatura. La espectrometría de masa, juega un papel muy importante en el análisis estructural de proteínas y péptidos, y puede ser utilizada para obtener el peso molecular de proteínas nativas, con mayor exactitud que usando la técnica de electroforesis en gel de polyacrilamida (SDC-PAGE); sin embargo, Beavis y Chait (2) desarrollaron un método para determinar con precisión, la estructura molecular de proteínas en leche humana y de bovinos por Espectrometría de Masa, sin usar pasos previos de separación cromatográfica.

En esta investigación fue planteado el siguiente objetivo : Determinar la masa molecular de la mayoría de los componentes proteicos en el tejido muscular de peces. Esta información puede ser usada como índice de identificación de diferentes especies con propósitos comerciales, ya que podría ser aplicada en un control de calidad de productos pesqueros.

MATERIALES Y MÉTODOS

Instrumentación:

El EM de rayos láser usado en este estudio, es conocido como un TOF-MS (Time of Flight Mass Spectrometer), de 2 m de longitud, modelo 10F-101 (Figura 1).

Este instrumento fue modificado para acomodar una fuente de iones láser a un voltaje de aceleración de 30Kv. Para la generación de iones fue usado un Láser Science modelo VSL - 337 ND, nitrógeno láser y un atenuador Newport, modelo 935-5- OPT. Las mediciones Láser fueron 106 w/cm2 para 10 ns (337) pulsos Láser. Los espectros fueron integrados en un Le-Croy 8109 A y luego transferidos a un 486/PC y evaluados por un Illys Software Package.

FIGURA 1. Diagrama esquemático del espectrómetro de mas de rayos láser.

FIGURA 1. Diagrama esquemático del espectrómetro de mas de rayos láser.

 

Preparación de la muestra:

El estracto de proteínas musculares de los peces, fue preparado para el análisis láser por un procedimiento estándar seguido en las técnicas electroforéticas, realizando maceración, filtración y ultracentrifugación, según AOAC (1 ) y sin usar pasos previos de purificación.

El material o sustancia para la matriz láser fue el Trans 3,5 dimetoxy, 4 hidroxy - cinnamicacid acid (Acido Cinapínico), disuelto en acetonitrilo (grado HPLC) y agua destilada en proporción 7:3 (v/v) para hacer una solución 0.05 M.

Una alícuota (10 µl) de esta matriz láser y 0.3 µl del extracto de proteínas, fue colocado en el extremo de la cánula (probe tip) de acero inoxidable y secado entonces a temperatura ambiente.

Una vez secadas, las muestras fueron introducidas para su análisis en el TOF - MS.

Los reactivos, todos de alta pureza, fueron obtenidos de Aldrich Chemical Company, mientras que las muestras de pescado, fueron adquiridas en un mercado local.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En este estudio, cuatro especies de peces fueron analizados y codificados como sigue:

a) Merluza (Merluccius bilinearis).
b) Bacalao (Gadus macrocephalus).
c) Salmón del Atlántico (Salmo salar).
d) Orange roughy fish (Arripis georgianus).

En el Gráfico 1 se señala los espectros obtenidos de las muestras de pescado analizadas en el TOF-MS. Solamente los picos de la región protéica, están representadas (no iones matrices). Puede observarse una región alta, de un espectro de masa de las especies estudiadas (a,b,c,d); donde cada especie tiene al menos, dos picos significativos, uno de los picos ( la señal entre 5.648,43 - 5.736,20 m/z) puede estar muy cercana o puede ser común en todas las especies, señala pequeñas variaciones (~ 4 residuos de aminoácidos), mientras que la señal observada con valores comprendidos entre 11.164,50 - 11.850,50 m/z, puede corresponder a la proteína que le da la especificidad a cada una de las especies.

Se observó la presencia de proteínas cuyo peso molecular varía entre 5.648,43 - 11.850,50 m/z, lo que indica que MALD-MS puede ser usada para medir el peso molecular de proteínas en estracto crudo de tejido muscular en peces, sin previa purificación y tal como lo señala Beavis y Chait (2 ), el análisis de un fluido, biológicamente crudo, no purificado, "no tiene precedente en la espectrometría de masa".

 

GRAFICO 1. Espectro MALD de cuatro especies de peces; a) Merluza (Merluccius bilinearís), b) Bacalao (Gadus macrocephalus), c) Salmón del Atlántico (Salmo Salar) y d) Orange roughy fish (Arripis Georgianus).

GRAFICO 1. Espectro MALD de cuatro especies de peces; a) Merluza (Merluccius bilinearís), b) Bacalao (Gadus macrocephalus), c) Salmón del Atlántico (Salmo Salar) y d) Orange roughy fish (Arripis Georgianus).

 

Estas medidas también sostienen la idea que esta técnica puede analizar moléculas que contienen largas cadenas de polipéptidos.

Por otra parte, cabe destacar que la sustancia utilizada como matriz láser, puede tener afinidad por las proteínas del tejido muscular en peces.

CONCLUSIONES

- Las proteínas del tejido muscular de las especies analizadas poseen un peso molecular entre  5.648,43 - 11.850,50 m/z.

- Existe como mínimo una proteína específica en cada una de las especies que puede ser utilizada para su identificación.

- MALD-MS, es una técnica rápida y precisa para determinar el peso molecular de las proteínas del tejido molecular en peces,
(aproximadamente l h, incluyendo la preparación de la muestra), medidas necesarias para la identificación de especies en peces.

- Pudiera ser empleado en un programa de control de calidad de productos pesqueros; además de la importancia que pudiera tener en bioquímica sistemática.

AGRADECIMIENTO

Investigación auspiciada por el Programa Intercambio Internacional "FULBRIGHT" Washington D.C. USA. Scholar 18146. 1994.

La autora desea expresar su agradecimiento al Dr. Akos Vertes, Departamento de Química de la Universidad George Washington, Washington D.C., U.S.A., por la lectura crítica del manuscrito, sus comentarios y sugerencias. Al señor X. Tang, estudiante de post-grado, Departamento de Química. Universidad George Washington,Washington D.C., U.S.A., por su ayuda en la realización de esta investigación. Al Dr. José N. Domínguez, Facultad de Farmacia. UCV., por sus valiosas recomendaciones.

RESUMEN

Con el propósito de determinar la masa molecular de proteínas en peces, como índice de identificación a ser usado con fines comerciales, cuatro especies de peces fueron analizadas utilizando la técnica Matrix-Assisted Laser Desorption (MALD-MS) y un TOF-MS (Time Of Flight Mass Spectrometer). Los resultados indicaron la presencia de una proteína específica en cada una de las especies estudiadas, con un peso molecular entre 11.164,50 - 11.850,50 m/z. El método MALD-MS, por su rapidez (aproximadamente 1 h) y exactitud, puede ser aplicada en el control de calidad de productos pesqueros.

Palabras claves: Peces, Proteínas, peso molecular.

Determination of structural mass of proteins in fishes using Matrix-Assisted láser Desorption.

 

SUMMARY

In order to ascertain the molecular mass of proteins in fishes, four fish species were analized, this information can be used as identification index for commercial purposes. The Matrix- Assisted Láser Desorption Mass Spectrometry and one TOF-MS was used in these analysis. The results of this study indicate that each specie has at least one peak, betwen 11.164,50 - 11.850,50 m/z, this means, that it correspond to a unique chemical structure. MALD-MS as a fast and accurate technique, it can be used in a quality control of sea food.

Key words: Fishes, molecular mass, protein.

BIBLIOGRAFÍA

1.- ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTRY (AOAC). Official Methods of Analysis. 13th. Ed. Washington, DC., USA. 1994.

2.- BEAVIS, R., CHAIT B. - Rapid Sensitive Analysis of Protein Mixture By Mass Spectrometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 6873-6877. 1990.

3.- COLTER, R. - Time of FligHt Mass Spectrometry For The Structural Analysis of Biological Molecules. Anal. Chem. 64 ,21. 1992.

4.- DIAZ, A.- INFORME TECNICO FONAIAP. PROYECTO 242-17002.Venezuela.1993.

5.- DAYHOFF, M.O., R.V., ECK. - Tracing Biochemical Evolution. Atlas of Protein Sequence and Structure. 5. Cap. 3. 1978.

6.- KARAS, M., U. BAHR. - MatriX- Assisted Laser desorption mass spectrometry. Mass Spect. Rev., 10 , 335 -357. 1991.

7.- lEVY,Jj., S, YUNES., BALDISERROTO, B. - identificaÇâo de filés de pescado através de electroenfoque. BoleT. Informativo. Serie Pesquisa. N º 29 . Brasil. 1983.

8.- LOWE, R.H. - Identification of Fishes. Methods for assesment of fish production fresh water. 3 th Ed. Blackwell-Scientific. Publication. 1978.

9.- NYMAN, L. - Specific proteins SPECIES in fresh water and their suitabIlity for a protein taxonomy. Hereditas, 53 , 117-126. 1965.

10.- VERTES, A., R. GIJBELS., F. ADAMS. - Laser ionization mass analysis. Chem. Anal. Series, vol. 124. John Wiley & Sons, Inc. USA. 1993.


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