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Agronomía Trop. 53(4): 483-499. 2003

PIGMENTOS CAROTENOIDES IDENTIFICADOS Y PURIFICADOS EN ACEITE DE PALMA

Nancy Salinas* y Emperatriz Pacheco-Delahaye**

*Profesora. Universidad de Carabobo.
Facultad Experimental de Ciencias y Tecnología.
Departamento de Química.
Valencia, estado Carabobo. Venezuela.
** Profesora. Universidad Central de Venezuela.
Instituto de Química y Tecnología.
Facultad de Agronomía.
Apdo. 2041. Maracay 2101, estado Aragua.

Venezuela. RECIBIDO: marzo 21, 2003.


RESUMEN

El aceite de palma, Elaeis guineensis, crudo es un alimento graso rico en carotenoides principalmente el ß -caroteno y a -caroteno, los cuales le proporcionan una fortaleza nutricional, ya que estos pigmentos son precursores de la vitamina A y están directamente relacionados con sus propiedades protectoras contra el daño de los radicales libres. Sin embargo, este aceite es refinado para su posterior consumo trayendo como consecuencia una pérdida de sus propiedades. En este trabajo se aplicaron técnicas para extraer, purificar, identificar y cuantificar algunos pigmentos carotenoides presentes en el aceite de palma crudo, pretratado y refinado; con la finalidad de realizar un posterior estudio de los factores más preponderantes en el proceso de refinación, que puedan ser optimizados para obtener un aceite con mayores cualidades nutricionales. Las técnicas cromatográficas empleadas fueron: cromatografía en capa fina (TLC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase reversa, previa saponificación con KOH metanólico, del aceite disuelto en acetona. Fueron identificados los pigmentos: ß -caroteno y sus isomeros, a -caroteno, luteína y licopeno en el aceite crudo pretratado. En el caso del aceite refinado no se observó la presencia de ningún pigmento carotenoide. Fueron cuantificados el ß -caroteno y sus isómeros: 1 158,198 mg kg-1; luteína y sus ¡someros: 42,819 mg kg-1; y licopeno: 14,179 mg kg-1.

Palabras Clave: Elaeis guineensis; aceite; palma; carotenoides.

INTRODUCCIÓN

La palma africana, E. Guineensis, es la segunda fuente de aceite comestible más importante del mundo y una de las que presenta el más alto contenido de aceite (45%), así como es el que tiene mayor campo de aplicación debido a su composición química única. Este aceite es una mezcla compleja de diferentes triglicéridos con distintos puntos de fusión, situados entre los -50 y 70 °C; difiere de los demás aceites vegetales comunes por su alto contenido en ácido palmítico (aprox. 45%). Debido a su composición semisólida a temperatura ambiente, se han desarrollo procesos como el fraccionamiento que han permitido la versatilidad y adaptabilidad del aceite de palma a diferentes aplicaciones alimentarías que han cobrado gran protagonismo (Abeshima, 1998; Che-Man et al., 1999; Sambanthamurthi et al., 2000).

En Venezuela, la producción de la palma aceitera se ha incrementado desde 1988, cuando se tenían 3.410 ha sembradas, hasta este año cuando se tienen aproximadamente 50 000 ha, principalmente repartidas entre los estados Zulia, Monagas y Yaracuy; es de hacer notar que sólo se tienen 4 plantas extractoras del aceite, pero su producción sólo representa el 20% del consumo del país, por lo que se hace necesario importar el restante en forma de aceite crudo.

Las refinerías de aceite de palma requieren un producto que se pueda refinar lo más moderadamente posible, para luego elaborar productos blandos, incoloros e inodoros que el consumidor exige. Sin embargo, la refinación actualmente aplicada es poco moderada, trayendo en consecuencia la imposibilidad de conservar la mayor cantidad posible de los antioxidantes naturales presentes en el aceite de palma crudo como los tocoferoles, tocotrienoles y carotenos que ayudan a proteger de la oxidación a dicho aceite, y que a su vez proporcionan una mayor calidad nutricional al alimento (Bustamante, 2001).

Hallazgos recientes han demostrado que tres micronutrimentos: la vitamina C, el ß -caroteno (provitamina A) y el tocoferol (vitamina E), estos dos últimos presentes en el aceite de palma, tienen propiedades protectoras contra el daño de los radicales libres que se cree son responsables de numerosas enfermedades degenerativas, tales como la artereosclerosis, artritis, carcinogénesis, etc (Hof et al., 2000; Roodembury, 2000; West, 2000).

Aunado a lo anteriormente mencionado, es conocido que la población nacional presenta una alta deficiencia en vitamina A, así como un consumo calórico muy por debajo (1 0%) de los estándares recomendados por la FAO y la OMS (30%) para el total de ingesta energética por grasas de un adulto (Bosch et al., 1995). Si este es el caso, entonces se debe enfatizar la importancia y estudio de los carotenoides del aceite de palma en el país.

El objetivo de este trabajo fue aplicar las técnicas de cromatografía en capa fina (TLC) y cromatografía líquida de alta resolución para extraer y purificar e identificar pigmentos caratoides presentes en el aceite de palma crudo para posteriormente comprender estudios que contribuyan a mejorar el proceso de refinación de este aceite.

MATERIALES Y MÉTODOS

Extracción y purificación de pigmentos

La extracción fue realizada en las muestras, señaladas en el Cuadro 1, siguiendo el método señalado por Mínguez (1997) que consiste en disolver cada muestra en 100 ml éter etílico; saponificar con 100 ml KOH metanólico al 20%, extraer hasta la neutralidad; filtrar por Na2 SO4 anhidro; evaporar y retomar con acetona. Para la extracción en fase sólida se acondicionó una columna de 9 cm octadecilsilano de 6 mi con el paso de 12 mi metano¡ y luego 1 0 ml de hexano; se pasó la muestra de aceite (Cuadro 1) disuelta en 4 ml de hexano; se esperó a que eluyera toda la materia grasa, agregándole 3 ml adicionales de hexano para asegurar la extracción de toda la grasa; se probó con un papel de filtro el extracto posteriormente recogido; se evaporó y disolvió en acetona para posterior análisis por cromatografía en capa fina (TLC) de acuerdo con Mínguez et al., 1984).

Identificación y cuantificación de pigmentos:

  1. Cromatografía en capa fina (TLC); Fase móvil: éter de petróleo 60-95' : acetona: dietilamina (10:4:1); fase estacionaria: placa (2Ox2O) de silicagel 60 HF254, espesor 1 mm (Merck)

  2. Cromatografia líquida de alta resolución (HPLC); Series 1 1 00 Hewlet Packard con arreglo de diodos: colunma C 1 8 fase reversa, 4,6 mm, 5 µ, régimen ¡socrático; fase móvii:acetonitrilo, metanol y tetrahidrofurano (58:35:7), flujo: 1,5 ml/min.

  3. Espectrofotometría ultravioleta (UV); Espectrofotómetro HP8452 con arreglo de diodos.

  4. Pruebas Químicas: a. acetilación de hidróxidos; b. 5,6 epoxidos; c. xantofilas con 2 grupos hidróxilos sin más sustituyentes (Gandul-Rojas et al., 1992; Mínguez et al., 1993; Mínguez, 1997; Bueno, 1997).

CUADRO1. Muestras de aceite de palma utilizadas en la extracción de los pigmentos.


N° Muestra

Tipo de aceite de palma

Peso (g)

Color


1

Crudo

2,8634

Rojo Naranja

2

Pretratado

2,9512

Rojo Naranja

3

Refinado

8,8712

Crema


RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Identificación inicial de pigmentos extraídos del aceite de palma

La identificación de los compuestos carotenoides se suele efectuar a partir de¡ extracto saponificado de pigmentos saponificados, para eliminar tanto los componentes clorofílicos como la presencia de lípidos (Mínguez, 1997), lo cual permite trabajar con un mayor tamaño de muestra y obtener cantidad suficiente de cada sustancia para verificar con las pruebas necesarias. Se tomaron en cuenta las propiedades de absorción, color y posición en TLC.

Las placas de TLC obtenidas de los extractos de las muestras se presentan en la Figura 1, donde se aprecia que hubo una separación claramente definida de los carotenoides; sin embargo, las bandas indican la presencia de licopeno, a y ß -carotenos y luteína, al presentar una coloración amarillo naranja muy fuerte a la luz blanca, así como también el fitoflueno bajo fluorescencia blanca amarillenta a 366 nm; estos pigmentos hacen el mismo recorrido en la placa en iguales condiciones de solvente. También se observó la posible presencia de¡ pigmento luteína 0 de zeaxanteno en las muestras, puesto que los patrones presentan un recorrido similar en la placa en relación al valor de Rf (0,41) y el color amarillo naranja bajo la luz blanca (Mínguez, 1997).

Identificación de pigmentos

A los extractos saponificados de las muestras 1 y 2 inyectadas en el UPLC se les tomaron los espectros de absorción de cada pico, no así a la muestra 3, en la que los picos obtenidos no demuestran espectroscópicamente la presencia de pigmento alguno. En los Cuadros 2 y 3 se muestran los tiempos de retención obtenidos, y los máximos de absorción para las muestras 1 y 2, puesto que, en general, la detección de los pigmentos mediante el uso de la espectroscopia UV-Vis se realiza entre 3 80-450 nm que es la zona de máxima absorción tanto para las clorofilas como para los carotenoides (Mínguez et al., 1996).

Los cromatogramas de ambas muestras presentaron los mismos picos, excepto por dos picos para la muestra 2 (picos 11 y 18 en el Cuadro 3), lo cual puede ser debido al proceso de pretratamiento del aceite crudo el cual es calentado por 30 min a 80 °C (Bailey, 1996), ocasionando la formación de compuestos que absorben en el UV-Vis. Se obtuvo con buena resolución la presencia de  a -caroteno, ß -caroteno y sus ¡someros, con tiempos de retención entre los 18 y 19 min (picos 20, 21, 22 y 23 en la Figura 2 ).

FIGURA 1. Placa de TLC de las muestras de aceite de palma. El color gris oscuro representa la coloración naranja que originalmente presentaron los carotenos.

FIGURA 1. Placa de TLC de las muestras de aceite de palma. El color gris oscuro representa la coloración naranja que originalmente presentaron los carotenos.


CUADRO 2. Tiempos de retención y máximos de absorción para el aceite de palma crudo (muestra 1) por HPLC.


Pico

Tiempo de retención (min.)

Área mAU/s

Máximo de espectros en UV-Vis (nm)


1

5,178

117,90

402-422-450

2

5,403

122,65

402-422-476

3

6,307

58,68

422-466-476

4

6,789

46,19

384-404-426

5

7,676

94,19

408-428-454

6

8,416

851,05

424-446-474

7

8,876

576,87

420-442-470

8

9,109

467,69

420-440-468

9

9,963

71,09

458

10

11,332

195,47

402-424-474

11

12,033

45,34

362-378-464

12

12,629

398,35

422-446-474

13

12,936

312,20

448-464

14

13,653

32,58

422-446-472

15

13,949

50,30

476

16

15,000

230,95

400-422-448

17

15,354

517,08

(410)-430-454

18

16,983

674,46

446-472-502

19

17,169

774,97

446-472-502

20

18,056

2,44 x 104

(421)-448-474

21

18,523

3,71 x 104

(425)-452-476

22

18,903

1,69 x 104

(424)-448-474

23

19,103

9  289,10

(424)-446-472


Los máximos de absorción que se aprecian en los Cuadros 2 y 3 para estos picos coinciden con lo señalado por Mínguez (1 997) para el ß -caroteno (426), 444, 470 nm, y muy bien con lo indicado en el CRC (1988) 426,451, 477 nm, así como también para el a -caroteno 421, 445, 474 nm.

Se procedió a identificar al licopeno, picos 19 y 22 en Cuadros 2 y 3, respectivamente, con máximos de absorción localizados a l mayores que las de los carotenos cíclicos antes nombrados; esto coincide con lo observado por Bonnie y Choo (2000) y por Mínguez (1997).

CUADRO 3. Tiempos de retención y máximos de absorción para el aceite depalma crudo (muestra 2) por HPLC.


Pico

Tiempo de retención (min.)

Máximos de expectros en UV-Vis (nm)


1

4,397

424-444

2

5,164

402-422-450

3

5,391

402-422-450

4

6,298

422-446-476

5

6,771

384-402-426

6

7,671

408-428-454

7

8,411

424-446-474

8

8,871

420-442-470

9

9,104

420-440-468

10

9,684

454

11

9,938

460

12

11,311

402-426-474

13

12,004

452-474

14

12,629

422-446-472

15

12,938

452-474

16

13,653

422-446-472

17

13,951

464

18

14,124

460

19

15,000

400-422-448

20

15,138

428-454

21

16,911

446-472-502

22

17,104

446-472-502

23

18,004

(421)-448-474

24

18,464

(425)-448-476

25

18,837

(424)-448-474

26

19,051

(424)-446-474



FIGURA 2. Cromatograma 1. Aceite de palma saponificado.

FIGURA 2. Cromatograma 1. Aceite de palma saponificado.

La interpretación de los espectros de absorción de los carotenoides es el resultado de¡ tipo de cromóforo presente, en este caso el sistema de dobles enlaces es el cromóforo responsable de la absorción. Un alto grado de conjugación resulta un cambio batocrómico del máximo espectral con un incremento en la absortividad. La linealidad de la molécula y la planaridad del cromóforo implica que un mayor grado la estructura fina (es decir las tres bandas del licopeno) pueden ser observadas, en contraste con el ß -caroteno donde ambos dobles enlaces endocíclicos están conjugados, dando un drástico decrecimiento en la estructura fina donde la banda de la longitud de onda más corta se reduce a un hombro (Ng y Tan, 1988), denotado en este trabajo por paréntesis en los Cuadros 2 y 3.

Es de hacer notar que tal como lo indican algunos autores (Clegg, 1973; Francis, 1995; Yeun et al., 1996; Ravigadevi et al., 2000), los pigmentos mayoritarios en el aceite de palma son el  a -caroteno y ß -caroteno, por lo que al realizar tanto la cromatografia por TLC como por HPLC, las altas proporciones de estos pigmentos obstaculizan grandemente el aislamiento e identificación de los demás pigmentos. En la cromatografia por TLC las placas se saturan muy rápidamente con poca cantidad de muestra (100-1 50 m l), y por HPLC los picos obtenidos son muy pequeños a excepción de los pigmentos mayoritarios.

Por lo tanto, con la finalidad de obtener un extracto de pigmentos en mayor proporción, exceptuando los carotenoides: alfa, beta, licopeno y los isómeros del beta, se aplicó la técnica de extracción en fase sólida, la cual no arrojó los resultados esperados, puesto que no. se pudo separar los pigmentos mayoritarios de los demás, pero se apreció la presencia de dos nuevas franjas, que no se observan en la muestra saponificada, lo que hace pensar que se debe a la existencia de pigmentos esterificados en la muestra original.

El análisis cromatográfico por HPLC de cada una de las franjas purificadas, así como de la muestra extraída por la técnica de extracción sólida (Figura 3), refleja que la muestra pasada por la columna presenta menor cantidad de picos (Cuadro 4) que la muestra saponificada (Cuadro 2) como era de esperarse, puesto que la saponificación puede modificar el estado natural en que se encuentran los carotenoides en la muestra; por lo tanto es necesario contar con los pigmentos desesterificados para verificar a través de las pruebas de identificación los grupos funcionales que puedan estar presentes; sin embargo, hay que aclarar que la identificación de este tipo de compuesto se suele efectuar a partir del extracto de pigmentos saponificados, para eliminar tanto los componentes clorofílicos como la presencia de lípidos, lo cual permite trabajar con un mayor tamaño de muestras y obtener cantidad suficiente de cada sustancia para verificar con las pruebas necesarias (Mínguez, 1997).

Dado que en el cromatograma general de la muestra de aceite de palma sin saponificar, y bajo saponificación (Figura 2 y 3), se aprecia que aparte del  a -caroteno y del ß -caroteno y sus isómeros, la posible luteína se encuentra en mayor proporción a los demás pigmentos minoritarios, se centró la atención en identificar este pigmento, a través de la quinta fracción obtenida por TLC (presente en la muestra saponificada y sin saponificar), la cual presenta tres picos (Figura 4), que tienen gran similitud con la luteína y sus isómeros, y donde su comportamiento espectroscópico presenta un máximo de absorción a 446 (pico 6 de¡ Cuadro 2, o pico 7, Cuadro 3) propio de numerosas xantofilas incluyendo la luteína (Lyan et al., 2001). Situación que se corrobora al disolver la fracción en diferentes solventes frente a una luteína patrón, ya que se presentan iguales máximos de absorción (Cuadro 5) a los señalados por Mínguez (1 997).

 

FIGURA 3. Espectros de absorción UV-Vis y cromatograma de aceite de plama sin saponificar

FIGURA 3. Espectros de absorción UV-Vis y cromatograma de aceite de plama sin saponificar


CUADRO 4. Tiempos de retención y máximos de absorción para la muestra de aceite de palma sin saponificar por HPLC.


Pico

Tiempo de retención (min.)

Máximos de expectros en UV-Vis (nm)


1

8,653

424-446-474

2

9,101

420-440-468

3

9,940

No presentespectro definido

4

11,646

No presentespectro definido

5

12,907

422-446-474

6

14,887

424-446-474

7

16,343

426-446-474

8

17,940

426-450-476

9

18,502

(424)-448-474

10

19,012

(426)-454-480

11

19,447

426-450-472


Pruebas químicas realizadas a la fracción 5

Prueba de acetilación de los hidróxidos.

Esta prueba fue realizada para xantofilas hidroxiladas, deteniendo la reacción a las 6 h. Al cromatografiar por el HPLC se observa que estaba completamente acetilado, presentando 4 picos. Esta prueba. fue repetida teniendo como variante que se detuvo a las 2 y 4 h, así como también la realización de la prueba a patrones de luteína y zeaxanteno. Los resultados obtenidos (Cuadro 6) si bien no son concluyentes de la existencia de luteína, y no de zeaxanteno, los espectros de absorción obtenidos de los picos de la muestra son más parecidos a la luteína que al zeaxanteno. En teoría la acetilación de la luteína produce dos derivados, y en el caso del zeaxanteno por presentar dos grupos OH simétricos, la prueba daría un único derivado (Mínguez, 1997).

Prueba de los 5,5 expóxidos

La prueba para descartar la presencia de 0-5,6 epóxido y corroborar así la luteina se realizó para dicha fracción 5, adicionando una gota de HCI 0, 1 N, el cual provoca la ruptura del supuesto anillo epóxido catalizado por los iones H', lo cual se evidencia por el desplazamiento hipsocrómico del espectro de absorción (Mínguez, 1997). En este caso la fracción disuelta en etanol produjo como máximos de absorción: 418, 444, y 472 nm, y al adicionar el ácido no se observó cambio alguno del espectro. Esta prueba demuestra la ausencia del piginento b-5,6 epóxido.

Prueba de xantofilas con dos grupos hidroxilos sin sustitución.

Esta prueba fue realizada a la fracción 5, luteína patrón concentrada, luteína patrón diluida y Violaxanteno, luego de colocar cada pigmento en una placa y desarrollarlos con la fase móvil éter de petróleo-acetona- dietilamina. Al rociar con HCI diluido al 50% del concentrado se observó que la mancha del patrón concentrado presenta un cambio de color de amarillo a marrón en la parte central y verde en los bordes, el patrón diluido cambia a un verde pardo, así como la mancha de la fracción 5, y el Violaxanteno presenta un cambio de amarillo a azul-lila. Al realizar esta prueba colocando los pigmentos en la placa de silicagel sin realizar el desarrollo con la fase móvil, se observa que, el amaffilo de la luteína y la fracción cambian a verde con borde marrón, situación característica de carotenoides dihidroxílicos puros (Mínguez, 1997).

FIGURA 4. Fracción 5 del aceite de palma saponificado.

FIGURA 4. Fracción 5 del aceite de palma saponificado.


CUADRO 5. Máximos de absorción de la fracción5 del aceite de palma.


Solvente

Máximos de espectros en UV-Vis (nm)
I  II  III

Según Mínguez (1997)
I  II  III


Éter de petróleo 40-60°

418-442-468

418-442-470

Cloroformo

430-442-470

430-452-482

Etanol

418-442-470

418-442-472



CUADRO 6. Prueba de acetilación de los hidróxidos


Pigmento

Tiempo de retención (min.)

Máximos de absorción (nm)


Lu acetilada x 2 h

8,639

422-448-474

10,283

422-446-476

12,343

426-448-476

Lu acetilada x 4 h

8,625

422-448-474

10,284

426-446-476

12,335

426-446-476

Lu acetilada x 2 h

8,770

454-480

10,284

(426)-454-480

12,696

(426)-454-480

Lu acetilada x 4 h

10,438

(426)-454-480

12,686

(426)-454-480

Fracción 5 acetilada x 2 h

8,726

422-448-472

Fracción 5 acetilada x 2 h

8,628

422-446-472

10,280

420-446-472


Siendo esta prueba positiva también para el pigmento zeaxanteno, se presenta la relación de picos III/II, la cual es de un 68%, superior en el caso de¡ espectro de la fracción 5 y para el zeaxanteno es de un 23%, 0 sea, es inferior al de la supuesta luteína como es característico de carotenoides con dos anillos de b -ionona (Mínguez, 1997).

Todo lo anteriormente expuesto permite afirmar con bastante certeza que uno de los pigmentos presentes en el aceite de palma crudo es la luteína, pigmento no estudiado hasta los momentos en la bibliografía consultada.

Con respecto a la cuantificación de los pigmentos en el aceite, sólo se realizó la cuantificación del ß -caroteno, licopeno y luteína tomando en cuenta los patrones existentes: ß -caroteno y sus isómeros: 1 158 mg kg-1; luteína y sus isómeros: 42 mg kg-1; licopeno: 14 mg kg-1. Hay que aclarar que los resultados que se presentan a continuación no pueden ser considerados completamente exactos, ya que no se utilizó patrón interno y/o externo.

A través de las cromatografías TLC y HPLC, espectrofotometría UV-Vis y pruebas químicas se pudo identificar con bastante precisión la presencia del pigmento luteína en el aceite de palma venezolano.

AGRADECIMIENTO

Al grupo del laboratorio de Pigmentos del Instituto de la Grasa. Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Sevilla. España, por su valiosa colaboración en la realización de este trabajo.

SUMMARY

Crude palm, Elaeis guineensis, oil is a rich in carotenoids, mainly ß -carotene and  a-carotene, which are precursors of vitamin A, and are directly related with their protective properties against the damage of free radicals. However when this fat is refmed for consumption a loss of its properties occurs. In this research, techniques were applied to extract, purify, identify and quantify certain carotenoid piginents present in crude, pretreated and refined palm o¡¡, in order to conduct a future investigation on most iniportant factors in the refming process with may be optimized to produce higher nutritional value in oil. Chromato raphic techniques 9 employed were thin ¡ayer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC) in reserve phase, with a previous saponifícation of oil dissolved in acetone, using methanolic KOH. The following pigments were identified in pretreated crude oil: 2-carotene and its isomers, a -carotene, lutein and lycopene. In refined oil no carotene pigments were observed. The quantification of 2-carotene and its isomers was 1 158,198 mg kg-1; lutein and its isomers 42,819 mg kg-1; and lycopene 14,179 mg kg-1.

Key Words: Oil; palm; carotenoids; Elaeis guineensis.

BIBLIOGRAFÍA

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