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Agronomía Tropical 50(2):167-188. 2000.

UTILIZACIÓN DE LA METODOLOGÍA DE SUPERFICIE 
DE RESPUESTA DE LA OPTIMIZACIÓN DE UN MEDIO 
DE CULTIVO  PARA LA PRODUCCIÓN DE L-LISINA
 POR Corynebacterium glutamicum

Armando Dreyer*, Nereida Coello* y Edie Montiel**

*Instituto de Biología Experimental, **Instituto de Zoología Tropical. 
Facultad de Ciencias. Universidad Central de Venezuela. 
A. P. 47279, Caracas 1041-A, Venezuela. 


RESUMEN

La utilización de la Metodología de Superficie de Respuesta (MSR), permitió la formulación de un medio de cultivo para la producción de L-lisina por una cepa (GIGO) de Corynebacterium glutamicum. Mediante ésta técnica, se logró un mejoramiento de la producción tomando en cuenta todas las variables (Melaza, ensilado de pescado, (NH4)2SO4, K2HPO4, KH2PO4) de manera simultánea y estableciendo la influencia de cada una sobre la cantidad de L-lisina producida. Con un mínimo de ensayos fue posible localizar mejorar la producción de L-lisina, observándose un incremento de la concentración final del aminoácido (34%) con respecto al valor obtenido en el medio original. 

Palabras clave: L-lisina, optimización, ensilado de pescado, melaza, Corynebacterium glutamicum

ABSTRACT

The effects of five ingredients of a culture medium designed for L-Lysine production were evaluated in order to select the variables which influenced amino acid production. Among them, fish silage molasses, (NH4)2SO4, K2HPO4, KH2PO4, showed a substantial effect on this parameter and were therefore selected. The optimum concentration for each variable was determined using an Orthogonal-Central Composite Experimental Design of the response-surface methodology. Applying this model, the optimum concentration was obtained. The L-lysine was increased in 34% with respect to the original medium using a strain (GIGO) of Corynebacterium glutamicum.

Key Words: L-lysine; fish silage; molasses; Corynebacterium glutamicum.

INTRODUCCIÓN

Existen en la literatura diferentes ejemplos sobre técnicas que hacen posible la optimización de los medios de cultivo. La mayoría de estas, basan la formulación de los mismos en la composición elemental del microorganismo a estudiar o de otros similares que puedan servir de referencia para realizar un balance de materia apropiado. Esto puede ser un punto de partida para la formulación y optimización de un medio de cultivo en particular, pero no suficiente ya que el crecimiento celular tiene implícito otros factores que determinan la estequiometría del mismo.

La optimización de los medios de cultivo con fines industriales, en la mayoría de lo casos ha sido efectuada mediante procedimientos empíricos de ensayo y error, no sólo en la formulación del medio de cultivo sino también en las condiciones de operación. De cualquier manera es probable que el medio de cultivo original pueda ser optimizado, modificando el porcentaje de los componentes del medio y las materias primas utilizadas, siendo factible en muchos casos optimizar un medio de tal manera que no sea solamente más productivo, sino de menor o igual costo que el original, para lo cual se requiere del uso de varios métodos de optimización (Maddox, 1977).

Una de las técnicas más eficientes para la optimización de procesos es La Metodología de Superficie de Respuesta (MSR); la cual tiene como objetivo principal determinar las condiciones de operación óptima para un sistema, o determinar la región del espacio de los factores en la que se satisfacen las condiciones de operación.

La MSR es utilizada con éxito en la industria química y en los últimos años se le ha dado aplicación en microbiología para la formulación de medios de cultivos, inclusive en la producción de L-lisina por procesos fermentativos usando extracto de levadura y glucosa entre otros componentes (Udeh y col.1993).

Es de resaltar que la MSR se basa en un conjunto de técnicas matemáticas y estadísticas, a través de las cuales es posible modelar y analizar problemas en los cuales una respuesta de interés es determinada por varias variables, siendo el objetivo de la misma optimizar esta respuesta.

Esta metodología tiene la particularidad de determinar la influencia e importancia de los parámetros estudiados y las interacciones entre estos con un mínimo de ensayos. Esto último contrasta con la metodología clásica, que consiste en hacer variar cada factor manteniendo los demás constantes, lo cual conduce por una parte a un número considerable de experiencias y por otra a ignorar la interacción que pueda existir entre los factores considerados.

En la mayoría de los casos la forma de la relación entre la respuesta y las variables independientes se desconoce. Por ello, el primer paso en la MSR consiste en determinar una aproximación apropiada a la relación funcional real entre la respuesta y el conjunto de variables independientes, guiando al experimentador rápida y eficientemente a la cercanía del punto óptimo; hasta finalmente localizarlo (Montgomery, 1986).

Un aspecto relevante en la optimización de un medio de cultivo de interés industrial no es sólo el logro de una formulación racional del medio, sino también la posible inclusión de materia prima de bajo costo que haga rentable el proceso. Ello ha llevado a la búsqueda de subproductos de bajo valor comercial que puedan sustituir componentes costosos del medio de cultivo y que puedan ser utilizados como fuentes de carbono o nitrógeno en los medios de cultivo, especialmente en la producción de L-lisina. Generalmente los medio de cultivo utilizados para la producción de L-lisina contienen sales, una fuente de nitrógeno (extracto de levadura, hidrolizados de proteína de soya, etc.), y una fuente de carbono (glucosa e hidrolizados de almidón).

Los desechos de la industria pesquera y de la captura accidental en la pesca de arrastre de camarón, así como de la pesca artesanal, han sido para nuestro laboratorio un aspecto de gran interés en la formulación de medios de cultivo para la producción de L-lisina por C. glutamicum, ya que estos desechos presentan un alto contenido de nitrógeno lo cual permite utilizarlos en forma de ensilados biológicos como sustrato fermentable. Otro producto que ha sido de gran interés como materia prima en la preparación de medios de cultivo es la melaza de caña, derivado de la industria azucarera, la cual puede ser utilizada como fuente de carbono y energía en los medios de cultivo (Yao-Tung-Liu, 1993).

MATERIALES Y MÉTODOS

Microorganismo

En el presente trabajo se utilizó una cepa de Corynebacterium glutamicun (GIGO) productora de L-lisina, resistente a 5-2 (aminoetil) - L-cisteína (AEC) y auxotrófica para Leucina (Leu-), Homoserina (Hom-).

Materiales

En este estudio se utilizaron reactivos marca Sigma. Co para la antrona, L-lisina, metil-celosolve y glucosa); Riedel de Haën, para todas las sales y el ácido sulfúrico grado analítico; Difco Co, para el extracto de levadura y Ultralab para el "kit" comercial de estimación de glucosa. El ensilado de pescado fue elaborado en el Instituto de Tecnología y Ciencia de los Alimentos UCV siguiendo el método descrito por Otatti et al, 1990 y Martínez et al, 1991.

Medios de Cultivo

La cepa GIGO conservada a 8 ºC en estrías de medio rico fue inoculada con un asa de platino en un medio de precultivo que contiene por litro de agua destilada: glucosa, 20 g; extracto de levadura 5 g; NaCl, 2,5 g; Tiamina, 300 µg; biotina, 400 µg, pH 7,2.

Los cultivos realizados en Erlenmeyer con bafles se incubaban a 30 ºC en un agitador rotatorio (200 r.p.m.) durante 16h. Para la producción de L-lisina, 10% de este precultivo fue transferido a una fiola con un medio que contiene los diferentes componentes a las concentraciones establecidas de acuerdo al diseño experimental planteado y un volumen final 20 ml.

Como control se empleó el medio con melaza utilizado previo a la optimización, el cual contiene por litro de agua: melaza 200g (100 g azúcares totales); ensilado de pescado, 65 g; biotina, 0,5 mg; tiamina 0,3 mg; (NH4)2SO4, 60 g; KH2PO4, 1 g; K2HPO4, 1 g; FeSO4, 0,01 g; MgSO4, 0,4 g; MnSO4, 0,01 g.

Los medios fueron esterilizados por autoclave (121 ºC 20 min.). Las vitaminas se esterilizaron por filtración (Millipore 0,22μ) y la glucosa y la melaza por autoclave pero separadas de los demás componentes del medio. La solución de ensilado de pescado (EP), se preparó suspendiendo 12 g de EP en 40 ml de agua destilada, se dejó hervir durante 15 minutos, se clarificó por filtración (Whatman No. 1 y se aforó al volumen inicial de 40 ml. Para reconstituir el medio de cultivo esta suspensión se adicionó a la solución de sales y azúcares previamente preparada.

El pH fue ajustado a 7,4 con KOH en estado sólido a fin de evitar alteraciones significativas del volumen final y para mantener el pH en el curso de la fermentación, se agregó 55 mg/ml CaCO3. Finalmente los cultivos se incubaban a 30 ºC, en un agitador rotatorio (250 r.p.m.) durante 144 h.

Determinaciones

Para el seguimiento de la cinética de fermentación, a diferentes tiempos durante la fermentación se tomaron muestras para realizar las estimaciones de biomasa, L-lisina excretada y azúcares consumidos. La biomasa fue determinada por turbidimetría (600 nm) y la conversión a peso seco se efectuaba mediante una curva de calibración previamente realizada. La determinación de L-lisina se realizó por el método colorimétrico de Chinard (1952). 

Los azúcares totales en los jugos de fermentación se determinaron por el método de antrona (Scott, 1953; Gerhardt, 1981) y la glucosa por el "kit" comercial de glucosa oxidasa (ULTRALAB). Las estimaciones de subproductos de fermentación (ácidos orgánicos) se realizaron por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, Waters Corporation) a 210 nm usando una columna RS-pak KC-811 y ácido fosfórico como fase móvil (0,1%).

Diseño Experimental

Para poder caracterizar la superficie de respuesta cercana al óptimo de producción de L-lisina se utilizó un diseño compuesto central de precisión uniforme (ver Tabla 1), con cinco variables independientes (ensilado de pescado, melaza, (NH4)2SO4, KH2PO4 y K2HPO4) y como variable dependiente la cantidad de L-lisina excretada. Este diseño contempla 52 tratamientos, de los cuales 32 (25) corresponden a un factorial, 10 tratamientos centrales y 10 tratamientos axiales con α = 2,191.

 

CUADRO 1. Codificación en cinco niveles de las variables consideradas en el diseño factorial fraccionado.



 Variable (g/l)

Nivel


-2,191

-1

0

+1

+2,191


Melaza

108,09

120

130

140

151,91

Ensilado de pescado

54,05

60

65

70

75,96

(NH4)2SO4

44,05

50

55

60

65,96

K2HPO4

0,45

0,75

1

1,25

1,55

KH2PO4

0,45

0,75

1

1,25

1,55


 

El diseño 25 no permite por si mismo la estimación del error experimental. De allí que se repitieran algunos ensayos (puntos centrales) los cuales permiten la determinación del error. Los puntos axiales o estrellas, al igual que los puntos centrales son importantes en la elaboración del diseño, ya que proporcionan estimaciones precisas en todas las direcciones, facilitando la ubicación del óptimo así como la estimación de los parámetros de segundo orden.

El diseño se llevo a cabo en 5 tandas diferentes (5, de 10 tratamientos c/u y uno con 12 tratamientos) debido a la dificultad de realizar todos las tratamientos simultáneamente y manteniendo constantes las demás condiciones ambientales del laboratorio. Este diseño confundido permitió reducir el error producido por los cambios en las condiciones de prueba (repique de la cepa, variaciones en la preparación de los medios, etc.) que podrían ocurrir por el tiempo transcurrido entre una tanda y otra, además permitió eliminar los efectos que ocasionan los bloques.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Reducción del número de componentes del medio de cultivo

La literatura (ICIDCA, 1990) reporta la presencia de vitaminas, tales como biotina y tiamina, así como de microelementos (Fe, Mg y Mn) en la melaza de caña de azúcar. Con la finalidad de probar si la melaza utilizada provee los elementos mencionadas, los cuales son agregados exógenamente al medio de cultivo, se procedió a suprimir estos componentes de dicho medio.

Para tal fin, se prepararon combinaciones de medio de cultivo en los cuales selectivamente se suprimieron las vitaminas (biotina y tiamina) y las sales FeSO4, MnSO4, y MgSO4. Estos ensayos fueron realizados por duplicado y transcurridas 144 h de fermentación se tomaron muestras de cultivo a fin de evaluar la biomasa producida y L-lisina excretada. Como control se utilizó el medio de producción de 10 componentes y melaza descrito en materiales y métodos.

Los resultados obtenidos (Figura 1) indican que en relación a los parámetros biomasa producida y L-lisina excretada, no hay diferencias significativos entre el control y las diferentes variantes probadas. Ello indica que la adición de melaza al medio de cultivo provee ciertos componentes en cantidades no limitantes, sin que sea necesaria su adición exógena, por lo que estos pueden ser suprimidos de la formulación original del medio de cultivo.

 

Figura 1. Efecto de la supresión de diferentes componentes del medio de cultivo sobre la producción de L-lisina y biomasa. Como control se utilizó el medio de producción con melaza de 10 componentes y el tiempo de fermentación fue 144 h. El error calculado (menor al 10%) corresponde al error del método de determinación de L-lisina y biomasa.

Figura 1. Efecto de la supresión de diferentes componentes del medio de cultivo sobre la producción de L-lisina y biomasa. Como control se utilizó el medio de producción con melaza de 10 componentes y el tiempo de fermentación fue 144 h. El error calculado (menor al 10%) corresponde al error del método de determinación de L-lisina y biomasa.

 

De esta forma el medio originalmente utilizado que contenía 10 componentes: ensilado de pescado, biotina, tiamina, (NH4)2SO4, KH2PO4, K2HPO4, FeSO4, MgSO4, MnSO4 y melaza pudo ser simplificado a 5 componentes. Quedando con la siguiente composición por litro de agua destilada: melaza, 100 g; ensilado de pescado, 65 g; (NH4)2SO4, 60 g; KH2PO4, 1g; K2HPO4, 1 g. Esta última formulación fue la utilizada como control para la optimización por Metodología de Superficie de Respuesta del medio de cultivo para la producción de L-lisina.

Optimización del Medio de Cultivo usando la Metodología de Superficie de Respuesta MSR

En este estudio no fue necesario realizar la etapa inicial "stepest ascent" para recorrer la trayectoria de mayor pendiente, ya que inicialmente los rangos de concentraciones a ensayar se seleccionaron en base a la experiencia y conocimientos previos utilizando como referencia las concentraciones de un medio glucosado optimizado por MSR (Coello y col., resultados por publicar) próximas de la región cercana al punto óptimo de producción de L-lisina; haciendo de esta forma, más corto el procedimiento y facilitando proseguir en la optimización del medio de cultivo con melaza de caña de cinco componentes descrito anteriormente.

La Tabla 2 muestra la matriz de datos de los 52 tratamientos realizados y los resultados experimentales obtenidos de producción de L-lisina y de biomasa en cada uno de ellos transcurridas 144 h de fermentación. Debido a la curvatura del sistema y a que el modelo de primer orden no era una aproximación adecuada, se hizo el ajuste de superficie a través de una función polinomial de segundo orden. Al observar los resultados obtenidos en cada una de los tratamientos, se puede notar que no todas las combinaciones probadas dan como resultado la misma cantidad de L-lisina, siendo los tratamientos No. 29 y No. 44 los más resaltantes por la cantidad de L-lisina producida: 31,20 y 32,76 g/l respectivamente.

Los resultados obtenidos fueron analizados mediante la técnica de regresión múltiple y de análisis de varianza (ANAVAR). Con ello fue posible determinar que un modelo de segundo orden podía ser una aproximación adecuada del sistema. Además, el análisis de regresión permitió establecer los coeficientes de significancia (CUADRO 3) y la ecuación que describe el modelo:

Donde A son los coeficientes. y X, los valores de concentración de las variables (CUADRO 3).

 

CUADRO 2. Matriz de diseño del modelo y resultados transcurridas 144 h de fermentación.


Tratamiento

Melaza

E.P

(NH4)2SO4

K2HPO4

KHçPO4

L-lisina (g/l)

Biomasa (g/L)


21

0

0

0

0

0

18,43

16,50

22

+1

+1

-1

-1

-1

19,89

18,60

23

+1

-1

+1

-1

-1

14,45

16,40

24

-1

+1

+1

-1

+1

29,66

15,95

25

-1

-1

-1

+1

-1

19,39

25,24

26

-1

+1

+1

+1

-1

16,70

18,69

27

+1

+1

-1

+1

+1

17,50

16,40

28

+1

-1

+1

+1

+1

16,00

20,90

29

-1

-1

-1

-1

+1

31,20

23,04

30

0

0

0

0

0

15,10

15,70

11

0

0

0

0

0

18,00

17,30

12

-1

+1

-1

-1

-1

19,05

16,20

13

-1

+1

-1

+1

+1

16,58

16,88

14

+1

-1

-1

+1

-1

18,58

16,29

15

+1

-1

-1

-1

+1

21,07

16,54

16

-1

-1

+1

-1

-1

18,26

14,77

17

+1

+1

+1

+1

-1

11,80

12,60

18

-1

-1

+1

+1

+1

19,54

16,67

19

+1

+1

+1

-1

+1

17,14

13,08

20

0

0

0

0

0

17,83

15,36

31

0

0

0

0

0

17,45

17,09

32

-1

-1

-1

-1

-1

28,18

22,23

33

-1

-1

-1

+1

+1

21,12

24,89

34

+1

-1

+1

+1

-1

14,09

15,61

35

-1

+1

+1

+1

+1

17,76

18,57

36

+1

+1

-1

-1

+1

26,57

20,17

37

-1

+1

+1

-1

-1

15,72

18,56

38

+1

-1

+1

-1

+1

16,97

16,88

39

+1

+1

-1

+1

-1

19,22

27,00

40

0

0

0

0

0

16,68

14,77

1

0

0

0

0

0

17,06

16,88

2

-1

+1

-1

+1

-1

20,02

18,15

3

+1

-1

-1

+1

+1

20,21

18,02

4

+1

+1

+1

+1

+1

11,19

12,50

5

+1

-1

-1

-1

-1

16,11

13,21

6

+1

+1

+1

-1

-1

15,60

16,40

7

-1

-1

+1

-1

+1

19,44

16,88

8

-1

-1

+1

+1

-1

17,66

16,90

9

-1

+1

-1

-1

+1

20,45

17,30

10

0

0

0

0

0

18,14

17,47

41

0

0

0

0

0

17,88

21,61

42

0

+2

0

0

0

14,78

16,30

43

0

0

0

0

+2

18,62

15,30

44

0

0

-2

0

0

32,76

27,22

45

0

0

0

0

-2

20,00

16,37

46

+2

0

0

0

0

11,80

14,60

47

0

0

+2

0

0

21,75

16,54

48

0

-2

0

0

0

23,74

17,38

49

0

0

0

+2

0

23,80

16,24

50

0

0

0

-2

0

25,37

17,30

51

-2

0

0

0

0

29,23

24,09

52

0

0

0

0

0

15,30

16,45


 

 

CUADRO 3. Coeficientes de la ecuación de regresión múltiple.


Variable

Coeficiente (A)


Constante

372,441

A: Melaza

-0,830521

B: Ensilado de pescado

-1,92983

C: (NH4)2SO4

-7,23478

D: K2HPO4

-30,4234

E: KH2PO4

16,8866

AB

0,0126775

AC

-0,012915

AD

0,1748

AE

-0,0483

BC

0,01968

BD

-0,3556

BE

0,0006

CD

0,1851

CE

0,2289

DE

-16,398

AA

0,00014

BB

-0,0047

CC

0,0618

DD

15,8306

EE

-1,7526


 

Tal como se muestra en el gráfico de Pareto (Figura 2) este tipo de análisis permite estudiar la influencia de las variables sobre la respuesta (producción de L-lisina) y las interacciones entre ellas. Se puede observar que la melaza junto con el (NH4)2SO4 y el K2HPO4 son los componentes del medio que más influyen sobre la producción de L-lisina. 

Es importante aclarar que el signo que presentan los coeficientes determina la forma como la variable influye en el sistema y da una idea de la dirección a seguir en los experimentos siguientes para ubicar el óptimo. Un signo positivo para una variable determinada, indica que debe incrementarse la concentración de este componente para aumentar la producción de L-lisina, del mismo modo el signo negativo indica que su concentración debe disminuirse. 

El valor absoluto da una idea de la magnitud del cambio que hay que hacer en la concentración del componente y de su efecto sobre la producción de L-lisina. En este sentido, el gráfico de pareto sugiere que las concentraciones de melaza, (NH4)2SO4 y K2HPO4 deben ser disminuidas. Esto último concuerda con lo obtenido en el gráfico cúbico (Figura 3) donde se observa que la mayor cantidad de L-lisina se alcanza cuando las concentraciones de estos tres componentes se aproximan a 120 g/l, 50 g/l y 0,75 g/l respectivamente.

El efecto anteriormente descrito se visualiza mejor en las curvas de superficie (Figura 4). En ellas podemos observar que la producción de L-lisina es mayor cuando nos aproximamos al valor mínimo del intervalo de concentración estudiado para la melaza, (NH4)2SO4 y K2HPO4, siendo la variable dependiente más sensible a los cambios en la concentración de estos dos últimos componentes que a los de melaza.

A fin de verificar el ajuste del modelo de la superficie descrita se realizó otro análisis de varianza al modelo, en el cual se evaluó el error producido en cada bloque separando y extrayendo este efecto, lo que garantizo más precisión en la estimación y ajuste del modelo. Este último aportó resultados similares al análisis previamente realizado, al indicar con mayor precisión el mismo orden de importancia de los componentes. El modelo fue chequeado estadísticamente con una prueba F y una significancia menor al 0,05 % (CUADRO 4).

 

Figura 2. Gráfico de pareto de las cinco variables estudiadas en la optimización (A: melaza, B: ensilado de pescado, C: (NH4)2SO4, D: K2HPO4, E: KH2PO4). Los valores al lado de la barra indican el coeficiente de contraste y el orden de importancia de los diferentes componentes del medio. La línea punteada indica el valor critico de significancia.

Figura 2. Gráfico de pareto de las cinco variables estudiadas en la optimización (A: melaza, B: ensilado de pescado, C: (NH4)2SO4, D: K2HPO4, E: KH2PO4). Los valores al lado de la barra indican el coeficiente de contraste y el orden de importancia de los diferentes componentes del medio. La línea punteada indica el valor critico de significancia.

 

 

Figura 3. Gráfico cúbico con los tres factores más importantes: melaza, (NH4)2SO4 y K2HPO4. En los vértices de este cuadro se representan las concentraciones teóricas de L-lisina esperada y el rango de los tres componentes probados en las rectas paralelas.

Figura 3. Gráfico cúbico con los tres factores más importantes: melaza, (NH4)2SO4 y K2HPO4. En los vértices de este cuadro se representan las concentraciones teóricas de L-lisina esperada y el rango de los tres componentes probados en las rectas paralelas.

 

 

 

Figura 4. Curvas de superficie ajustadas a los datos del diseño central compuesto. Tomando en cuenta las tres variables dependientes consideradas como las más importantes en la optimización del medio producción (melaza, (NH4)2SO4 y el K2HPO4).

Figura 4. Curvas de superficie ajustadas a los datos del diseño central compuesto. Tomando en cuenta las tres variables dependientes consideradas como las más importantes en la optimización del medio producción (melaza, (NH4)2SO4 y el K2HPO4).

Figura 4. Curvas de superficie ajustadas a los datos del diseño central compuesto. Tomando en cuenta las tres variables dependientes consideradas como las más importantes en la optimización del medio producción (melaza, (NH4)2SO4 y el K2HPO4).

 

 

CUADRO 4. Análisis de varianza del modelo de superficie de respuesta. para la L-lisina (5 factores) F: prueba de Fisher, P: prueba de significancia. *0,05 nivel de significancia. R2 = 0,754138.


Efecto

Suma de Cuadrados

Grados de libertad

Media cuadrado

Estadístico F

Valor P


A: Melaza

205,782346

1

205,78235

19,79

0,0001

B: Ensilado de pescado

33,005452

1

33,00545

3,17

0,0860

C:(NH4)2SO4

183,110509

1

183,11051

17,61

0,0003

D: K2HPO4

74,964389

1

74,96439

7,21

0,0122

E: KH2PO4

28,878731

1

28,87873

2,78

0,1071

AB

12,857520

1

12,85752

1,24

2759

AC

13,343778

1

13,34378

28,2672

 

AD

6,111008

1

6,11101

0,59

0,4580

AE

0,466578

1

0,46658

0,04

0,8361

BC

7,746048

1

7,74605

0,75

0,4048

BD

6,322568

1

6,32257

0,61

0,4505

BE

0,000018

1

0,00002

0,00

0,9990

CD

1,713100

1

1,71310

0,16

0,6923

CE

2,619760

1

2,61976

25

0,6251

DE

33,611800

1

33,61180

3,23

0,0834

AA

0,893776

1

0,89378

0,09

0,7747

BB

0,642384

1

0,64238

0,06

0,8082

CC

106,648589

1

106,64859

10,26

0,0035

DD

43,700001

1

43,70000

4,20

0,0502

EE

0,535665

1

0,53567

0,05

0,8245

Block

100,750272

4

25,18757

2,42

0,0727

Total error

280,687052

27

10,39582

 

 

Total (tratamientos)

1141,64326

51

 

 

 


 

Del análisis de los resultados anteriores, se planteó la posibilidad de que se hubiese alcanzado o se estuviese muy próximo a un punto estacionario o de pendiente cero. Ello hizo necesario caracterizar la superficie de respuesta en la vecindad inmediata de este punto estacionario usando la ecuación canónica. Esta última es una ecuación de segundo orden que describe el modelo trasladado a un nuevo sistema de coordenadas, con el origen en el punto estacionario rotando los ejes del sistema hasta que fuesen paralelos a los ejes principales de la superficie de respuesta ajustada. (Montgomery, 1986). Este análisis permitió determinar si el punto estacionario era un punto de respuesta máxima, mínima o punto silla de montar (Box, 1978).

La naturaleza de la superficie de respuesta puede determinarse a partir del punto estacionario, del signo y de la magnitud de los coeficientes en la ecuación. En el caso que nos concierne, la ecuación canónica mostró coeficientes tanto de signos positivos (melaza, (NH4)2SO4 y K2HPO4), como negativos (EP y el KH2PO4) lo que indica la presencia de una superficie tipo "silla de montar."

Para corroborar lo anterior se realizaron 4 tratamientos adicionales (CUADRO 5) en la proximidad del punto estacionario y se compararon los valores experimentales obtenidos de L-lisina con los valores teóricos esperados. La cantidad de L-lisina producida experimentalmente no correspondió con la teórica esperada, lo cual confirma que se trata de una superficie tipo "silla de montar". Ecuación canónica:

Y = Yo + 0.6304[melaza]2 - 1.248 [EP]2 + 1.937 [(NH4)2SO4]2 + 1.652 [K2HPO4]2 - 0.524 [KH2PO4]2

Yo: Punto estacionario       EP: Ensilado de pescado

Los bajos niveles de producción obtenidos en estos ensayos (CUADRO 5, tratamiento 3 y 4) pueden explicarse desde un punto de vista fisiológico, ya que se tratan de situaciones extremas de cultivo. Una baja concentración de melaza impone limitaciones en la fuente de carbono, así como de otros elementos indispensables (vitaminas, sales, etc.), de igual forma ocurre con el ensilado de pescado y los demás componentes del medio. Por el contrario, una alta concentración de estos componentes, produce cambios físico químicos, tales como un aumento de la osmolaridad del medio, lo cual puede afectar no sólo el crecimiento sino también la producción de L-lisina por parte del microorganismo.

 

CUADRO 5. Producción de L-lisina en los tratamientos adicionales.


Tratamiento

Melaza (g/l)

E P (g/l)

(NH4)2SO4 (g/l)

K2HPO4 (g/l)

KH2PO4 (g/l)

L-lisina (g/l)


1

108

57

26

-

1,3

22,65

2

112,5

58

25

0,03

1,3

22,47

3

193,5

90

137,5

4

0,03

5,21

4

4

12

1,75

1,6

0,9

0


 

De la función que describe el modelo de segundo orden se calculó el punto estacionario de manera teórica, derivando esta ecuación en forma matricial. Las coordenadas de este punto obtenidas por este método, se sustituyeron en la ecuación canónica para calcular la cantidad de L-lisina producida en las condiciones del punto estacionario. De ello resultó que la concentración de L-lisina obtenida teóricamente era 5 g/l, una cantidad inferior a la obtenida en los 52 tratamientos. Este valor calculado de L-lisina indica que se trata de punto estacionario ubicado en la zona de mínimos de la superficie "silla de montar" contrario a lo que se deseaba (un punto máximo). Utilizando la ecuación canónica y el método de Ridge (Montgomery, 1986), sería posible continuar explorando la superficie de respuesta en la vecindad de este punto estacionario con experimentos adicionales diseñados para tal fin.

Por otra parte, la ecuación canónica muestra que bajo este sistema y en referencia al punto estacionario calculado teóricamente, las variables más importantes son el EP con signo negativo, indicando que es recomendable su reducción y las sales de (NH4)2SO4 y K2HPO4, con signo positivo, indicando que éstas deben aumentarse en los próximos ensayos. 

En su conjunto los resultados experimentales mostraron que los tratamientos 29 y 44 son los más apropiadas para la producción de L-lisina, dado los altos niveles estimados en estas condiciones. Sin embargo, aún cuando el tratamiento 44 (melaza 130 g/l, ensilado de pescado 65 g/l, (NH4)2SO4 44 g/l, K2HPO4 1 g/l y KH2PO4 1g/l) produjo cantidades de L-lisina comparables con lo obtenido en el tratamiento 29 (melaza 120 g/l, ensilado de pescado 60 g/l, (NH4)2SO4 50 g/l, K2HPO4 0,75 g/l y KH2PO4, 1,25 g/l), puede notarse que en éste último se requieren menores concentraciones de tres de los componentes utilizados (melaza, EP, K2HPO4).

En cuanto a la cantidad de biomasa producida en el tratamiento 29, esta es menor que la obtenida en el tratamiento 44, lo que indica que el rendimiento (YX/P) bajo esta condición es mayor. En un estudio realizado con otra cepa bacteriana y un medio de cultivo que contiene extracto de levadura, se han reportado concentraciones óptimas de los componentes del medio utilizado (Udeh et al., 1993).

Estudio comparativo de las cinéticas de fermentación antes y después de la optimización

Por las razones expuestas anteriormente, la formulación del medio correspondiente al tratamiento No. 29 fue seleccionada como óptima para realizar el estudio comparativo de la cinética de fermentación en los medios antes y después de optimizar. 

La Figura 5 muestra los resultados obtenidos con la cepa GIGO cultivada a 30 oC y 250 r.p.m. en los referidos medios durante 144 horas. En dicha figura puede observarse que la cepa GIGO inicia su crecimiento, en ambos casos, luego de un periodo de latencia de 10 horas aproximadamente y alcanza un valor de biomasa de 11,47 g/l en el medio optimizado y 7,42 g/l en el medio sin optimizar a partir de las 40 horas de cultivo. Este valor permanece constante durante las 30 horas siguientes en el medio optimizado, para luego incrementar hasta 20 g/l al final de la experiencia. En el caso del medio sin optimizar, este valor de biomasa permanece constante por mucho más tiempo (60 horas) y luego incrementa hasta 14 g/l a las 144 horas, tiempo en el cual finaliza el experimento.

En cuanto a la producción de L-lisina, se observa que ésta se inicia a partir de las 20 horas de cultivo y la excreción de este metabolito parece prolongarse hasta el final del experimento, siendo esto más notable en el medio optimizado, donde se alcanzan aproximadamente 31 g/l de L-lisina en los jugos de fermentación. Cabe destacar que la producción de L-lisina resulta favorecida cuando comienza a decaer el crecimiento del microorganismo (Coello et al , 1992).

El cese en el crecimiento del microorganismo y la producción de L-lisina no parecen ser debidos al agotamiento de la fuente de carbono ya que la concentración remanente de azúcares totales fue de 22 g/l al final del experimento. Ello sugiere que otras limitaciones nutricionales podrían estar afectando tanto la producción de biomasa como de L-lisina en estas condiciones. Finalmente, puede observarse que las tendencias de las curvas para la biomasa producida, la L-lisina excretada y los azúcares remanentes son similares en ambos casos. Sin embargo, los valores de biomasa producida y L-lisina excretada en el medio optimizado son mayores. Consecuentemente, las velocidades de producción de biomasa y de L-lisina son también mayores en esta condición, lo cual es una ventaja porque permite reducir los tiempos de operación.

 

Figura 5. Comparación de las cinéticas de crecimiento, L-lisina excretada y consumo de azúcares totales de la cepa GIGO de el medio antes de optimizar y el optimizado (tratamiento Nº 29 del diseño experimental). Antes de optimizar () y Optimizado ().

Figura 5. Comparación de las cinéticas de crecimiento, L-lisina excretada y consumo de azúcares totales de la cepa GIGO de el medio antes de optimizar y el optimizado (tratamiento Nº 29 del diseño experimental). Antes de optimizar () y Optimizado ().

 

AGRADECIMIENTO

El presente estudio fue financiado mediante fondos de los proyectos BTI-88 del Programa de Nuevas Tecnologías del BID-CONICIT y 03-33.4163-98 del Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad Central de Venezuela .

BIBLIOGRAFÍA

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Gerhardt. D. (1981) Manual of Methods for General Bacterilogy. Total Carbohydrates by anthrone reaction. American Society for Microbiology USA, pp 333.

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