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Agronomía Tropical. 44(2): 299-315.1994

OBTENCION DE AISLADOS PROTEINICOS DE GIRASOL POR HIDROLISIS CON BROMELINA Y PAPAINA, COMPOSICION QUIMICA 
Y PROPIEDADES FUNCIONALES

Emperatriz Pacheco de Delahaye* ; Mariela Sánchez A.**
Rosa Girlando** ; Eliezer Sánchez**


*
Profesor Asociado. Universidad Central de Venezuela. Facultad de
 Agronomía. Apado. 5081. El Limón. Aragua. Venezuela.
** Universidad Central de Venezuela. Facultad de Agronomía. 
Apdo. 5081. El Limón. Aragua. Venezuela.

RECIBIDO: febrero 12, 1993


RESUMEN

Harina de girasol desgrasada industrialmente fue molida a 60 mallas y utilizada de base para obtener aislados de girasol por vía alcalina y por hidrólisis con bromelina (0.4%) y papaína (0.2%), lográndose aislados que contenían entre 88% y 92% de proteína. La hidrólisis enzimática mejoró notablemente el índice de blancura de los aislados proteínicos de 33% a 53%. Igualmente se incrementaron las propiedades funcionales de absorción de agua (2.1 a 3.4 ml agua/ g muestra); absorción de aceite (2.0 a 3.2 ml aceite/g); actividad de la emulsión (74% a 90%). La solubilidad de la proteína soluble fue mayor en los aislados enzimáticos en todo el rango de pH estudiado (3-9). La hidrólisis con papaina demostró ser más eficaz en términos de rendimiento. Los aislados obtenidos presentaron buenas propiedades funcionales y podrían ser utilizados para enriquecer productos de consumo masivo, ampliando el uso potencial del subproducto del aceite de girasol.

Palabras Claves: Helianthus annuus L.; propiedades funcionales; uso po-tencial; subproducto; papaína; bromelina.

INTRODUCCION

Las harinas desgrasadas de oleaginosas de soya, ajonjolí, girasol y algodón representan una importante fuente de proteínas, sin embargo, su empleo directo en la alimentación humana se ve impedida por la presencia de componentes antinutricionales como por ejemplo: resíduos de cáscara que provocan problemas de sabor y olor, inhibidores enzimáticos, fitatos y oxalatos. Por ello se hace necesario la aplicación de procesos tecnológicos dirigidos a la remoción parcial o total de estos contaminantes (BRESSANI y ELIAS, 1968 y CHOI et al., 1981).

El cultivo de girasol se destaca por el valor nutritivo de la semilla, debido al alto contenido de aceite en la almendra (58-63%); además, es una fuente de proteínas, vitaminas y minerales que puede ser utilizada como complemento en la alimentación humana por presentar varias alternativas de usos en la agroindustria (COBIA y ZIMMER, 1975 y DENCH et al., 1981). El mayor problema que presenta la harina de girasol en la alimentación humana es la presencia de cáscara y polifenoles de difícil remoción dando como resultado una harina de color verde oscuro (VOLKERT y KLEINI, 1979; WANG y KINSELLAS, 1976).

Para la incorporación en productos alimenticios de harinas y aislados proteínicos a partir de semilla de oleaginosas, estos deben poseer ciertas propiedades funcionales, cuyos requerimientos varían con los diferentes tipos de alimentos. Las propiedades funcionales de las proteínas son aque-llas caraterísticas físico-químicas que influyen de un modo característico sobre la apariencia física y el comportamiento de un producto alimenticio, siendo los más importantes las propiedades emulsificantes, solubilidad, capacidad de gelatización, absorción de agua, absorción de aceite y propiedades organolépticas especialmente color y sabor (FRAZEN, 1976; KINSELLA et al., 1979).

Los tratamientos enzimáticos en la preparación de aislados aumentan el rendimiento de extracción y modifican la estructura proteínica, mejorando así sus propiedades funcionales y ampliando el rango de alimentos en los cuales podrían ser incorporados. La eficiencia de este proceso dependerá de la enzima utilizada y de los parámetros que afectan el proceso químico-enzimático (DENCH et al., 1981; FUJIMAKI et al., 1977 y PACHECO, 1985).

En Venezuela, el cultivo comercial del girasol presenta un nivel de desarrollo agronómico relativamente avanzado, observándose en los últimos años (1988-1990) un aumento sustancial en la producción, situándose según los datos publicados por el MINISTERIO DE AGRICULTURA Y CRIA (1987; 1990) como una de las principales oleaginosas en el país. Es importante conocer las características químicas y propiedades funcionales que presenta la harina de girasol producida por la industria nacional, con el objeto de evaluar su potencial como suplemento en alimentos.

Con base en los argumentos planteados anteriormente, el presente trabajo tuvo los siguientes objetivos: evaluación química de la harina y la obtención de aislados proteínicos de girasol mediante hidrólisis enzimática con papaína y bromelina.

MATERIALES Y METODOS

Materiales

La torta de girasol utilizada en este estudio fue obtenida industrialmente mediante un proceso de extracción mecánica y extracción con solvente (hexano), usado por la empresa LAURAK situada en la ciudad de Maracay, estado Aragua, Venezuela. La torta fue obtenida de la mezcla de semilla de híbridos de girasol tipo aceitera de las variedades Contiflor II y Dogri, procedentes de los Llanos Orientales de los estados Monagas y Anzoátegui. La torta comercial de girasol fue sometida a una operación de molienda y tamizado, para ello se utilizó un molino de martillo marca Willey, modelo 4, con tamiz de 60 mallas, obteniéndose una harina que sirvió de base para la experimentación. Las enzimas empleadas fueron de la marca comercial Sigma.

Preparación de los aislados proteínicos por vía alcalina y por vía enzimática a partir de harina desgrasada de girasol.

El aislado proteínico por vía alcalina fue obtenido aplicando el método señalado por PACHECO (1985). Los aislados proteínicos por vía enzimática se obtuvieron siguiendo el esquema de la Figura 1, previa fijación de la concentración óptica de las enzimas bromelina y papaína para lo cual se siguió el método publicado por BEUCHAT (1977).

 

FIGURA 1. Preparacón de os aislados enzimáticos a partir de la hidrólisis de a harina de girasol con bromelia o papaina.
FIGURA 1. Preparacón de os aislados enzimáticos a partir de la hidrólisis de a harina de girasol con bromelia o papaina.

 

 

Análisis químico

Los contenidos de grasa, cenizas, proteínas (% N x 6.25) y polifenoles totales fueron determinados según la técnica señalada en el A.O.A.C. (1975) y se analizó la fibra dietética por el método de ASP et al., (1983). Estos análisis se realizaron por triplicado.

Propiedades funcionales

La solubilidad de las proteínas de los aislados de girasol fue determinada según la técnica de RIVAS et al., (1981). Para el cálculo de porcentaje de proteína soluble (PS), se empleó la relación siguiente:

Proteínas soluble a pH determinado
% PS = -----------------------------------------------------x 100
Proteína en la muestra

El color fue determinado por la medida del índice de blancura analizado en un colorímetro triestímulo marca Gardner XL-10. El instrumento fue calibrado previamente con una placa estándar blanca, cuyos valores fueron L = 92.83; a = -1.1 y b = + 0.3. Se calculó en índice de blancura (IB) mediante la ecuación IB = Valor L de la muestra/valor L de la placa estándar blanca x 100.

Absorción de agua

La absorción de agua se determinó según el método de WANG y KINSELLA (1976), con algunas modificaciones: 100 ml de agua destilada se añadieron a 1 g de muestra, dentro de un tubo de centrífuga graduado de 50 ml. La mezcla se agitó por 1 minuto con agitador Vortex modelo K-500-Y para dispersar la muestra y seguidamente se colocó en Shaker (Wrest Action) marca Burrel, modelo 75, durante 30 minutos a la máxima velocidad para luego ser centrifugada a 3700 r.p.m durante 25 minutos en una centrífuga IEC HN-5 rotor 215. El volumen de agua liberada fue medido y el agua absorbida por gramo de muestra se calculó como ml H2O absorbida por la muestra. Los cálculos fueron hechos mediante la ecuación siguiente:

Agua absorbida (ml) x 100
Agua absorbida = ----------------------------------------------------………...……
Peso de muestra (g)

Las determinaciones fueron hechas por triplicado.

Absorción de aceite

La absorción de aceite fue determinada por el método descrito por DENCH (1981), con algunas modificaciones: a 0.5 g de muestra se le adicionó 3 ml de aceite de maíz en un tubo de centrífuga graduado de 50 ml. El contenido fue agitado por 1 minuto con agitador Vortex modelo K-500-Y para dispersar la muestra. Se dejó en reposo la muestra durante 30 minutos y el volumen de aceite libre fue leído. El volumen de aceite retenido fue calculado; luego se centrifugó a 3700 r.p.m, por 25 minutos y el volumen de aceite retenido fue calculado por diferencia y los resultados fueron expresados en ml de aceite absorbido por 1 g de muestra. Los ensayos fueron realizados por triplicado.

Propiedades emulsificantes

Para determinar la actividad emulsificante y la estabilidad de la emulsión se utilizó el método descrito por DENCH (1981) con algunas modificaciones.

En el primer caso se pesaron 2.5 g de muestra, los cuales fueron transferidos a un beaker de 100 ml y suspendidos en 30 ml de agua destilada; el pH de la suspensión se ajustó a 7.0 con NaOH 0.1N y se agitó magnéticamente durante 15 minutos a media velocidad en un agitador a temperatura ambiente; el pH fue chequeado y ajustado en los casos necesarios, el volumen fue llevado a 50 ml con agua destilada. La suspensión fue pasada al vaso de licuadora donde se adicionó 50 ml de aceite de maíz para ser emulsionada durante 3 minutos a máxima velocidad. La emulsión fue dividida en 2 tubos de centrífuga graduado de 50 ml para ser centrifugada a 2 900 r.p.m por 5 minutos en una centrífuga IEC-HN-5 rotor 215. La actividad de la emulsión fue calculada como:

Altura de la capa emulsificada (ml) x 100
% Actividad emulsificante = -----------------------------------------------------------

Altura total del contenido en el tubo (ml)

Para calcular la estabilidad de la emulsión se repitió el método utilizado para determinar actividad emulsificante con la siguiente variación: antes de la centrifugación, se calentó la emulsión a 80oC por 30 minutos y se enfrió con hielo durante 15 minutos.

Los resultados fueron expresados de acuerdo a la siguiente manera:

Altura de la capa emulsificada (ml) x 100
% Actividad emulsificante = ------------------------------------------------------------

Altura total del contenido del tubo (ml)

Análisis estadístico

Los resultados de los análisis químicos y propiedades funcionales fueron determinados a través del análisis de varianza y prueba de DUNCAN (1955). El análisis de varianza (Anavar) se realizó según SOKAL y ROLHJ (1979) donde siguiendo el modelo completamente aleatorio, el cual es apropiado para comparar más de dos medias, permitiendo cotejar todas las observaciones simultáneamente en función de las medias de cada grupo.

RESULTADOS Y DISCUSION

Efecto de concentración de las enzimas sobre la extracción de proteínas.

Con la finalidad de fijar las concentraciones óptimas de las enzimas de bromelina y papaína, empleadas en este trabajo para la extracción de proteínas para obtener aislados proteínicos a partir harina de girasol, se determinó el porcentaje de proteína soluble producido por la hidrólisis a diferentes concentraciones de las enzimas comerciales (0.05; 0.1; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8 g de enzima/100 g de harina), y se fijó el pH 9; temperatura 25oC y relación harina-solvente (1:20). Los resultados se presentan en el Cuadro 1, donde se aprecia que la hidrólisis con papaína soluble es mayor a cualquier concentración de enzima. Por otra parte, al agregar 0.6 g de bromelina/100 g de harina de girasol se obtuvo 30 % de PS en agua para luego disminuir, y fue a 0.4% donde se observó un cambio drástico de extracción de proteína.

En el caso de la papaína 0.2 g de enzima/100 g de harina de girasol, ésta es la concentración donde prácticamente se estabiliza el porcentaje de extracción de proteína (48%). En función de los resultados observados y tomando en cuenta que el costo de las enzimas podría encarecer el aislado proteínico, se escogieron las concentraciones mínimas de enzimas con las cuales se logra una mayor extracción; en tal sentido, se escogió la concen- tración de 0.4 g de bromelina y 0.2 g de papaína por 100 g de harina de girasol para efectuar la hidrólisis y obtener los aislados enzimáticos. Diferentes autores han demostrado que la hidrólisis enzimática mejora la extracción de las proteínas y la digestibilidad de los productos como aislados e hidrolizados debido posiblemente al cambio de estructura de la proteína original, dando como resultado de la hidrólisis una mezcla de polipéptidos de alto peso molecular (HENDERSON, 1979; Ma y WOOD).

CUADRO 1. Efecto de la concentración de Bromelina y Papaína sobre la extracción acuosa de las proteínas de la harina de girasol.


Concentración

Proteína extraída (%)(g proteína/100 g harina)*

(g de enzima/100 g de harina)

Bromelina

Papaína


0.2

10.94

48.26

0.4

27.34

50.25

0.6

30.08

51.12

0.8

29.39

50.89

1.0

28.44

50.73


* Promedio de tres determinaciones.
 

Es conveniente conocer el rendimiento de extracción de proteínas para la producción de aislados o concentrados a escala industrial ya que de ello depende la factibilidad económica del proceso. El Cuadro 2 presenta los rendimientos en peso de los procesos de obtención de los aislados por vía alcalina y por vía enzimática, donde se puede resaltar que tanto los rendimientos en extracción de proteína como en peso fueron superiores al emplear las enzimas, y prácticamente el rendimiento fue el doble al compararlo con el aislado alcalino donde la harina de girasol no fue hidrolizada. Resultados similares fueron encontrados al obtener aislados e hidrolizados proteínicos de algodón y de ajonjolí (CHILDS y FORTE, 1976; SOSULSKI y BAKAL, 1969).

Composición química de la harina y aislados proteínicos de girasol obtenidos por vía alcalina y enzimática

Los análisis de proteína, grasa, cenizas, fibras dietética total y polifenoles se detallan en el Cuadro 3. La cantidad de proteína y grasa de la harina de girasol encontrada coincide con valores mostrados por BAIRD (1981); sin embargo, la cantidad de ceniza es un poco más elevada quizás por el alto contenido de cáscara en la semilla que durante el proceso industrial no fue totalmente descascarada, hecho que se resalta en el contenido de fibra dietética total el cual es elevado (38%). La hidrólisis elimina durante el proceso de extracción de proteínas la mayor parte de fibra dietética, cenizas y grasas.

 

CUADRO 2. Rendimiento en peso y porcentaje de proteína extraída en la elaboración aislados de girasol: alcalino y enzimáticos con bromelina y papaína.


Aislado

Rendimiento en peso*
(g aislado/100 g harina)

Proteína extraída
(g proteína/100 g harina)


Alcalino

12.65 0.75

32.45 ± 1.32

EnzimáticoBromelina(0.4 g enzima/ 100 g harina)

17.18 ± 0.45

48.52 ± 0.56

EnzimáticoPapaína(0.2 g enzima/ 100 g harina)

20.15 ± 0.88

55.55 ± 1.17


* Promedio de 6 determinaciones.
 

Se logró obtener aislados en base seca con más de 90% de proteína; se determinaron diferencias significativas entre el aislado alcalino y los aislados enzimáticos en el análisis químico. Los aislados enzimáticos presentan menor cantidad de proteína probablemente porque durante la hidrólisis de la harina de girasol se aumenta el número de polipéptidos solubles que son descartados en el sobrenadante luego de la centrifugación, disminuyendo por lo tanto el contenido de proteína en el precipitado (Figura 1). En cuanto al contenido de polifenoles, resulta beneficioso la hidrólisis con las proteasas bromelina y papaína, ya que se puede apreciar que los aislados enzimáticos contienen 60% menos de polifenoles que el aislado alcalino. Al minimizar o destruir la cantidad de los polifenoles (capaces de formar complejos con las proteínas que reducen su valor biológico) es posible mejorar la digestibilidad de los aislados. Es lo que ocurre probablemente durante la proteólisis enzimática, al destruir la estructura terciaria de ciertas proteínas (BRESSANI y ELIAS, 1968; BRESSANI et al., 1987).

 

CUADRO 3. Composición química de la harina y de los aislados proteínicos de girasol: alcalino y enzimáticos con bromelina y papaína.

Muestra

Proteína

Grasa

Ceniza

FDT***

Polifenoles Totales


Harina*

37.80 ± 0.20

0.80 ± 0.18

6.34 ± 0.28

34.12 ± 1.10

0.42 ± 0.80

Aislado*
alcalino

92.76 ± 1.32a**

0.38 ± 0.07a

4.48 0.02a

4.63 ± 0.05a

0.48 ± 0.05

Aislado*
enzimáticoBromelia

88.12 ± 0.68b

0.21 ± 0.03b

1.96 ± 0.02b

2.24 ± 0.04b

0.20 ± 0.05

Aislado*
enzimáticoPapaina

89.25 ± 0.72b

0.22 ± 0.04b

1.98 ± 0.02b

2.30 ± 0.03b

0.20 ± 0.04


* Porcentaje en base seca.
** Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas al nivel P = 0.01 (Test de Duncan)
*** FDT = Fibra dietética total.
 

Propiedades funcionales de los aislados proteínicos de girasol

El análisis de las propiedades funcionales de los aislados alcalinos y los enzimáticos se expone en el Cuadro 4. Es notable el efecto de la hidrólisis enzimática sobre el color de los aislados, resultando éstos más claros (beige), con una diferencia en el índice de blancura de 20% al compararlos con el color del aislado alcalino (verde oscuro).

El color es una de las propiedades funcionales más importantes ya que el contacto visual es el primero que se tiene con el producto alimenticio que se va a consumir, siendo en efecto uno de los principales indicadores de la calidad de un producto. El color debe tomarse muy en cuenta cuando se van a enriquecer harinas de cereales (maíz, arroz, trigo) con aislados proteínicos ya que éstos no deben modificar el color visible de las harinas para preparar, por ejemplo, panes, arepas, galletas, etc.

Se ha observado que durante la producción de concentrados o aislados proteínicos de semilla de girasol tipo aceitera, los polifenoles oxidados forman enlaces covalentes con las proteínas, impartiendo un color verde al producto (VOLKERT y KLEINI, 1979 y CHERYAN, 1980). El color aislado alcalino producto de este trabajo se debe quizás a la disminución de los polifenoles por la hidrólisis enzimática.

Como pueder notarse en el mismo Cuadro 4, la absorción de agua de los aislados enzimáticos mostró valores significativamente más elevados que el aislado alcalino. Probablemente la disociación de las proteínas nativas por la acción enzimática incrementa la capacidad de absorción de agua de las proteínas, debido al aumento de puentes de hidrógeno, grupos carbócilos y aminos libres que se producen al romper las proteínas con enzimas (SOKAL y ROLHT, 1979).

La absorción de aceite es una propiedad que debe tomarse en cuenta especialmente al incorporar concentrados de proteínas a productos de panaderías ya que los mismos contribuyen a la textura de tortas y galletas (DENCH et al., 1981). Los aislados enzimáticos muestran valores superiores de absorción de aceite que el aislado alcalino. La proteína al ser hidrolizada por una proteasa (en este caso bromelina o papaina) produce cadenas polipeptidicas cada vez de menor tamaño, aumentando así los extremos no polares y a su vez la absorción de aceite. Los valores obtenidos son superiores al compararlos con los datos de la bibliografía para harina y aislado de soya. Esto supone que las proteínas de girasol contienen más grupos lipofílicos

que puedan enlazar cadenas parafinadas de grasa contribuyendo así a la absorción de aceite. Cuando se realizó el análisis de las propiedades emulsificantes se observó que la actividad de la emulsión aumenta en los aislados enzimáticos, debido a la hidrólisis enzimática de las proteínas que incrementan el número de péptidos disponibles en la interfase aceite-agua, dando como resultado una mayor emulsificación de aceite tal como lo explican KINSELLA et al., 1979 y PACHECO y RIVAS, 1992.

Todas las emulsiones formadas por las diferentes muestras estudiadas fueron estables al calor y el volumen de la emulsión aumentó durante el calentamiento, debido quizás a que la hidrólisis de las proteínas aumenta el área superficial y en consecuencia se incrementan los residuos polares expuestos.

 

CUADRO 4. Propiedades funcionales de los aislados proteínicos de girasol: alcalino y enzimáticos con bromelina y papaína.

Aislado

Indice de
blancura

Absorción**
agua (ml de agua absorbido/g de aislado)

Absorción**
aceite (ml de aceite absorbido/g de aislado)

Actividad
**emulsificante
(%)

Estabilidad**
emulsificante
(%)


Alcalino

33.3 ± 0.00

2.10 ± 0.10b

2.06 ± 0.09b

74 ± 0.8b

77 ± 10b

Enzimático-Bromelina

53.15 ± 0.22

3.50 ± 0.10b

3.20 ± 0.12a

91 ± 3a

92 ± 5a

Enzimático-Papaína

52.08 ± 0.28

3.46 ± 0.15b

3.25 ± 0.10a

90 ± 4a

93 ± 4a


* X ds
** Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas al nivel de P = 0.01 (Test de Duncan).
 

Solubilidad proteinica de los aislados de girasol

El efecto del pH en la solubilidad proteínica de los aislados alcalinos y enzimáticos de girasol se presentan en el Cuadro 5, se aprecia que en todo el rango de los pH estudiados, los aislados enzimáticos mostraron mayor solubilidad que el aislado alcalino. Este incremento en la solubilidad podría explicarse por la acción enzimática que genera al romper la estructura molecular, péptidos más pequeños que aumentan la solubilidad en agua y la resistencia a la precipitación en medio ácido (FUJIMAKI et al., 1977 y PACHECO, 1985).

CONCLUSIONES

El presente trabajo de investigación demuestra que es posible mejorar las propiedades funcionales de los aislados proteínicos de girasol aplicando la técnica de extracción alcalina e hidrólisis con bromelina y papaína. Los aislados obtenidos representan una buena fuente de proteína y una alternativa para el aprovechamiento de un subproducto el cual sólo es destinado a la alimentación animal y que podría ser utilizado en la formulación de productos de consumo masivo, específicamente galletas, panes, productos cárnicos. Sin embargo, cabe señalar que este trabajo continúa con estudios nutricionales.

En lo referente al rendimiento de extracción y propiedades funcionales es más conveniente obtener aislados proteínicos de girasol mediante hidrólisis con papaína.

 

CUADRO 5. Efecto del pH sobre la solubilidad proteínica de los aislados de girasol: alcalino y enzimáticos con bromelina y papaína.


-

PS (%)*

Aislado

pH

3

4

5

6

7

9


Alcalino

-

26.2

7.7

7.6

7.8

20.6

38.5

Enzimático-Bromelina

-

44.9

30

25.6

15.6

28.5

53.8

Enzimático-Papaína

-

42.5

35.2

28.7

16.8

47.3

58.3


PS (%) = Porcentaje de proteína soluble.
* Promedio de 3 determinaciones.
 

AGRADECIMIENTO

Los autores agradecen el financiamiento parcial otrogado por el CONICIT Proyecto S1-2266 y al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la UCV, Proyecto 01.37.2490-91.

Los investigadores expresan su agradecimiento a la señora Gloria de Pinto por su ayuda técnica.

SUMMARY

Sunflower kernel industrially unfatted, was ground to 60 mesh and used to obtain sunflower isolates via alkaline and by hydrolisis with bromeline (0.4%) and papain (0.2%). Isolates obtained contained from 88% to 92% protein. The enzymatic hydrolisis remarkably improved the whiteness index of the protein isolates from 33% to 53%. In the same way, the functional properties increased: the water absorption (2.1 to 3.4 ml water/gr. sample); oil absorption (2.0 to 3.2 ml oil/gr.): emulsion activity (74% to 90%). Soluble protein solubility was greater on the enzymatic insolates in the whole rank of pH (3-9) studied, The hydrolisis with papain showed to be more efficient in terms of yield. The isolates obtained showwed good functional properties and may be isolates to enrich products of massive consumption, increasing therefore the potential use of the sunflower oil by-product.

Key Words: Helianthus annus L.; functional properties; potencial use; subproducts; bromeline and papain.

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