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Agronomía Tropical. 39(4-6): 249-268.1989

PROPAGACION CLONAL DE PLANTAS DE CAFÉ (Coffea arabica L. 'Catimor') A PARTIR DE MICROESQUEJES CULTIVADOS IN VITRO

Eva G. de Garcia* y Margarita Rafael* 

* Universidad Central de Venezuela Facultad de Ciencias. Centro de Botánica 
Tropical. Apdo. 47114. Caracas 1041. Venezuela.

RECIBIDO: febrero 22, 1989.


RESUMEN

El cafeto 'Catimor' (Coffea arabica var. 'Caturra' x Híbrido de Timor ) constituye un cultivar de particular interés por la alto resistencia que presenta frente a la roya anaranjada (Hemilia vastatrix Berk y Br.), combinada con importantes características agronómicas como son buena calidad en taza, alto rendimiento y bajo porte. En este trabajo se estudió su micropropagación, tomando en cuenta la influencia de nutrimentos y el efecto de las condiciones de crecimiento de la planta donadora, sobre el establecimiento y producción de brotes a partir de microesquejes aislados del cafeto Catimor cultivados in vitro. Los explantes procedentes de plantas crecidas in viva presentaron problemas de oxidación que fueron controlados al colocar las plantas donantes a una baja intensidad luminica, pretratando los explantes con una mezcla antioxidante (300 mg/1 de ácido ascórbico + 100 mg/1 de ácido cítrico, previo a su cultivo en medio líquido con cisteína (60 mg/l). En los microesquejes aislados de plantas in vitro se determinó que aquellos constituidos por el nudo apical presentan una mayor capacidad de brotación in vitro que los nudos subyacentes. Una alto concentración de BAP, entre 12 y 16 mg/l, permitió romper la latencia de las yemas, incrementándose el porcentaje de explantes con brotes sin BAP de 5,ó% a 62%. Estudios morfoanatómicos comparativos realizados en plantas in vitro, a los tres mesas de crecimiento, revelaron la preservación de características juveniles. Los cálculos realizados basados en los resultados obtenidos perrniten afirmar que el rendimiento potencial de la metodología empleada en este trabajo (5 793 a 10 985 vástagos en un año), para la propagación vegetativa del Catimor, es superior al reportado para los métodos hortícolas convencionales (100 a 200 vástagos en dos años).

P.C.: Coffea arabica, cultivo de tejidos, microesquejes, regeneración.

INTRODUCCION

E1 cafeto 'Catimor' (Coffea arabica cv. 'Caturra Rojo' x Híbrido de 'Timor') es un cultivar de particular importancia, ya que combine una alto resistencia a todas o casi todas las razas conocidas de la roya anaranjada (Hemileia vastatrix) con características agronómicas deseables como: bajo porte, rendimiento, vigor, así como calidad de la bebida idéntica a las "arábicas" tradicionales (2).

Se estima que la propagación a gran escala de genotipos de café mejorados medionte métodos hortícolas convencionales tomaría más de 30 años, tiempo que resulta demasiado largo en vista de la amenaza inminente de la roya. Una posible solución al problema es la propagación vegetativa in vitro de aquellos genotipos mejorados, resaltantes de los programas de hibridización y selección, lo cual aceleraría el proceso y permitiría hacer una selección más precoz, ya que el cultivo in vitro conduce a un coeficiente de multiplicación macho mayor que la reproducción vegetativa por vía hortícola, por permitir la ruptura de la latencia de las yemas y un rápido crecimiento de las mismas, lo que da lugar a un verdadero "brote en cascada".

la multiplicación por medio de microesquejes es una de las formas más prácticas de utilización de este método in vitro, y ha resultado de primordial importancia para la conservación y reproducción a gran escala de genotipos excepcionales.

En la presente investigación se analizan los requerimientos nutricionales y ambientales necesarios para lograr una multiplicación clonal eficiente del cafeto 'Catimor', medionte el uso de microesquejes. Se analiza, además, la influencia de la edad y condiciones de crecimiento de la planta donadora sobre el establecimiento y producción de brotes a partir de dichos microesquejes.

REVISION DE LITERATURA

Se denomina propagación por microesquejes al método que se basa en el cultivo de una sección (explante) proveniente del vástago de la planta (nudo o entrenudo), con el fin de obtener nuevos vástagos medionte el desarrollo de yemas preexistentes o neoformadas, las cuales podrán, a su vez, proporcionar nuevos esquejes, o ser enraizados, obteniéndose así múltiples plantitas, idénticas, en principio, a la planta madre (13).

E1 primer informe sobre microesqueje en café fué el realizado por SHARP et al. (14) en el que se obtuvo la formación de brotes y raíces a partir de explantes caulinares ortótropos y plagiótropos de C. arabica cv. 'Mundo Nuevo' y cv. 'Bourbon Amarillo'.

De gran importancia han sido las investigaciones realizadas en esta área por DUBlIN (4, 5, 6) con el híbrido 'Arabusta'. En éstas se ha logrado el de desarrollo de vástagos que posteriormente fueron enraizados a partir de yemas preformadas o neoformadas, de nudos o entrenudos, respectivamente. Basándose en sus investigaciones, DUBlIN (5, 6) concluye que la estrategia de esqueje in vitro para Arabusta comprende las fases siguientes a) obtención y multiplicación de los microesquejes, b) enraizamiento y c) traspaso a condiciones ordinarias de cultivo. Por otra parte, el autor estima que un solo microesqueje podría proporcionar, en un año, 20 000 plántulas aproximadamente, lo que significa un altísimo rendimiento, el cual unido a la garantía de conformidad genotípica que ofrece esta técnica, lo convierte en una muy buena alternativa para la propagación masiva de genotipos interesantes.

Otros investigadores que también han aplicado exitosamente las técnicas de microesquejes son NAKAMURA y SONDAHl (11), quienes trabajaron con nudos de ramas ortótropas de C. arabica cv. Mundo Novo, obteniendo el desarrollo del 45% de las yemas preformadas, con una eficiencia de 7,5 plántulas por nudo cultivado en sólo seis meses.

En Venezuela, RAFAEL (13) obtuvo la regeneración de plantas completas de Catimor, a partir de microesquejes procedentes tanto de plantas crecidas in viva como in vitro por embriogénesis somática. E1 medio utilizado el de MURASHIGE y SKOOG (MS) (10), suplementado con distintas concentraciones de Bencilaminopurina (BAP) y Acido Naftalenacético (ANA). En este trabajo se señala la superioridad en rendimiento de la metodología empleada cuando se compare con los métodos hortícolas convencionales. VIZCAYA (16) también ha informado sobre la obtención de brotes in vitro a partir de microesquejes de Catimor.

Otro aspecto importante en la micropropagación in vitro de café es la inducción de embriogénesis somática. Al respecto se puede mencionar el trabajo de GARCIA y MENENDEZ (7), en el cual se logró la formación hasta de 75 embrioides por explante foliar de Catimor, utilizando primero un medio para la inducción del callo embriogénico [MS/2, 8 mg/I BAP y 1 mg/1 de Acido 2,4-diclorofenexiacético (2,4D)], y posteriormente otro medio para la diferenciación de los embrioides (MS/2 y 10% de agua de coca). En la misma línea de la embriogénesis, ASCANIO (1) informa sobre la formación indirecta de abundantes embrioides haploides, en anteras de C. arabica var. Garnica, las cuales habían sido pretratadas con bajas temperaturas (5°C, por 24 h) y cultivadas en medio MS con 2 isopenteniladenina (2iP), Benciladenina (BA) y ANA en diferentes concentraciones.

MATERIALES Y METODOS

Material vegetal

Se extrajeron microesquejes de plantas de Catimor obtenidas, tanto in vitro como in vivo. E1 material in vitro fué obtenido por MENENDEZ (9) por embriogénesis somática, y crecido durante un tiempo de seis a diez meses en el medio de cultivo MS-1, en una cámara de crecimiento Forma Scientific, con iluminación continua de 2600 lux a 27 + 1°C. Las plántulas se mantuvieron en estas condiciones hasta alcanzar una altura de 2 a 5 cm, con un número de pares de hojas entre 3 y 12. E1 material in viva estaba constituido por plantas de Catimor jóvenes (3 a 10 mesas) y adultas (3 a 3,5 años) correspondientes a la F6, descendientes de progenie CIFC 960 (F5) y pertenecientes a los grupos fisiológicos de resistencia A y 1. Estas plantas crecieron bajo las condiciones ambientes siguientes: en un salón con luz continua de baja intensidad (300 lux), a temperatura ambiente (26 + 2°C); regadas coda tres días y tratadas periódicamente con fertilizante (Bayfolan 9,3%), insecticida (Nudrín 5 mg/1) y fungicidas (Benomyl, 1 a 10 g/1, Cupravit, 3,5 g/1 o Ridomil, 10 g/1).

Aislamiento de explantes a partir de plantas obtenidas in vitro. Bajo la campana de flujo laminar, en condiciones de asepsia, se cortaron con bisturí, sobre placas de Petri, trozos de vástagos de las plántulas obtenidas in vitro. Los trozos comprendían el último por de hojas, con la yema apical.y varios pares de hojas más desarrolladas. E1 tallo desfoliado se dividió en microesquejes, tomándose en cuenta el nivel del vástago correspondiente a coda uno, para asignarle el No. 1 al nudo apical, el No. 2 al siguiente, y así sucesivamente hasta llegar al nudo más viejo. Estos explantes fueron sembrados inmediotamente en tubos de 2,5 x 20 cm, contentivos de cultivo, los cuales se mantuvieron en una cámara de crecimiento Forma Scientific a 27 + 1°C y con un fotoperíodo de 16 h a 2 600 lux.

Aislamiento de explantes a partir de plantas obtenidas in vivo. Las porciones aisladas y desfoliadas de ramas ortrótopas o plagiótropas, de las plantas crecidas in vivo, formadas por el nudo apical, un entrenudo y el nudo secundario subyacente, fueron sometidas al proceso de desinfección siguiente:

a) lavado en agua corriente con jabón iodado;

b) inmersión en hipoclorito de calcio al 3,5%, vacío parcial (-21 lb) y frío durante 20 minutos;

c) tres enjuagues con agua destilada estéril;

d) inmersión en mezcla fría y esterilizada de Benomyl (500 mg/1) y Gentamicina (500 mg/1), durante 30 minutos, en vacío parcial (-21 Lb);

e) corte de los microesquejes en mezcla esterilizada y fría de ácido ascórbico (300 mg/1) y ácido cítrico (100 mg/1), en la que se dejan por 10 minutos, para controlar la oxidación;

f) paso por alcohol isopropílico (90%), durante cuatro segundos antes de sembrar.

 

Después de la desinfección se extrajeron y sembraron los microesquejes de la misrna forma que se hizo con el material de in vitro, y se colocaron en una cámara con fotoperíodo de 16 horas a 2 600 lux, y 27 _ 1°C.

Medios de cultivos.

Todos los medios de cultivo empleados en este trabajo fueron preparados con las sales minerales del medio basal de MURASHIGE y SKOOG (10), completas o diluidas a la mitad (MS/2), según se requiriera. La constitución de la porción orgánica de dichos medios varió dependiendo del objetivo década experiencia y se ajustó el pH a 5,7 con NaOH o HC1 1 N. Se prepararon tanto medios líquidos como sólidos, utilizándose para estos últimos Gelrite (2 g/1). Se autoclavaron a 121°C y 1,2 kg/cm2 durante 15 minutos.

Medio para el crecimiento de embriones somáticos (Medio MS-I).

Este medio fué preparado en estado sólido, con las sales MS diluidas a la mitad, mio-inositol (100 mg/1), tiamina (10 mg/1), hidrolizado de caseína (100 mg/1), cisteína (35 mg/1), sacarosa (30 g/1), suplementados con AIB (5 mg/1) y 2iP (1 mg/1).

Medios para microesquejes de plantas obtenidas in vitro.

Todos los medios de cultivo preparados para este tipo de explantes contienen las sales de MS completes, tiamina (1 mg/1), mio-inositol (100 mg/1), ácido nicotínico (0,5 mg/1), piridoxina (0,5 mg/1), glicina (2 mg/1) y sacarosa (40 g/1), diferenciándose entre si en la concentración de BAP y ANA que poseen (Cuadro 1' y en el estado físico del medio.

Medios para microesquejes de plantas crecidas in vivo.

Todos los medios preparados para el cultivo de explantes de plantas crecidas in viva contienen las sales completes de MS, mio-inositol (100 mg/1), tiamina (1 mg/1), ácido nicotínico (0,5 mg/1), piridoxina (0,5 mg/1), glicina (2 mg/1) y sacarosa (40 g/1). A los mismos se les añadió 80 ó 100 mg/1 de Gentamicina para combatir la contaminación bacterial y 500 mg/1 de Benomyl para controlar la contaminación fungal.

Medios para el análisis del efecto del BAP e interacción BAP/ANA en el crecimiento de los microesquejes.

Para estudiar el efecto de la concentración de BAP y de la combinación BAP/ANA, se sembraron los microesquejes en medios en los que se ensayaron las concentraciones de BAP siguientes: 4 mg/1, 8 mg/1, 10 mg/1, 12 mg/1 y 16 mg/1 (medios MS-14, MS-16, MS-18, M~20 y M&21, respectivamente, Cuadro 1).

CUADRO 1. Medios para microesquejes de plantas crecidas in vitro.

 

BAP

ANA

Cist.

Gelrite

Medio

mg/l

mg/l

mg/l

mg/l


MS-12

-

-

40

0,62

MS-13

2

-

60

0,62

MS-14

4

-

60

0,62

MS-15

4

0,5

60

0,62

MS-16

8

-

60

0,62

MS-17

8

0,5

60

0,62

MS-18

10

-

60

0,62

MS-19

10

0,5

60

0,62

MS-20

12

-

60

-

MS-21

16

-

60

-

MS-22

-

-

40

-

MS-23

1

-

40

-

MS-24

1

1

40

-

MS-25

2

1

40

-

MS-26

4

1

40

-


NOTA: todos los medios contienen las sales de MS completes, tiamina (1 mg/ 1), mio-inositol (100 mg/1), ácido nicotinico (0,5 mg/1), piridoxina (0,5 mg/1), glicina (2 mg/1) y sacarosa (40 g/1).

 

Otros medios fueron suplementados con BAP y ANA en las proporciones siguientes: 4 mg/1 BAP/0,5 mg/1 ANA; 8 mg/1 BAP/0,5 mg/1 ANA y 10 mg/1 BAP/0,5 mg/1 ANA (medios MS-15; M-17; MS-l9, respectivamente, Cuadro 1).

Medios de enraizamiento de vástagos obtenidos.

Algunos de los vástagos producidos in vitro, con un número de pares de hojas entre tres y echo, y una longitud de 0,8 a 2 cm, fueron asépticamente separados del explante original y sembrados en medios para el enraizamiento. Los medios contenían las sales de MURASHIGE y SKOOG diluidas a la mitad y los compuestos orgánicos correspondientes, cisteína (40 mg/1), sacarosa (10 g/1) y auxinas: ANA o AIB (Cuadro 2).

Evaluación del crecimiento de los microesquejes.

la evaluación se realizó sernanalnente medionte la observación del material sembrado, con la ayuda de un microscopio estereoscópico Bausch and

 
CUADRO 2. Medios para el enraizamiento de los vástagos producidos in vitro.

 

 

Cist.

BAP

ANA

AIB

SAC

Gelrite

Medio

MS

mg/l

mg/l

mg/l

mg/l

g/l

mg/l


MS-27

1/1

40

-

-

2

30

-

MS-28

1/1

40

0,1

2

-

30

-

MS-29

1/1

40

-

1,5

0,5

30

-

MS-30

1/1

60

-

-

2

30

2

MS-31

1/1

60

-

 

~5

30

2

MS-32

1/2

60

-

-

2

30

2

MS-33

1/2

60

-

-

5

30

2

MS-34

1/2

60

-

10

-

10

2

MS-35

1/2

60

-

-

10

10

2

MS-36

1/2

60

-

-

-

10

2


NOTA: todos los medios contienen tiamina (0,1 mg/1), mio-inositol (100 mg/ 1), ácido nicotínico (0,5 mg/1), piridoxina (0,5 mg/1) y glicina (2 mg/1).


Lomb. Se tomó en cuenta el número de explantes que produjeron brotes, el número de brotes por explantes y él número de pares de hojas por brote.

A los tres meses de cultivo se estimó el número de huevos microesquejes que se podrían obtener a partir de coda explante inicial (rendimiento), para lo cual se consideró que coda brote producido puede proporcionar tantos microesquejes como nudos tenga.

 

Se tabularon los valores basándose en el promedio del total de replicas (10), sembradas en coda condición y se graficaron para su comparación.

Para establecer si las diferencias que se presentaron entre los dates de un tipo de explante determinado, a distintas concentraciones hormonales (BAP, o BAP/ANA), eran estadísticamente significativas se realizó la prueba de KRUSKAl-WAllIS (15). Los dates correspondientes a explantes diferentes fueron confrontados medionte la prueba de KOlMOGOROV-SMIRNOV, para determinar su grado de significación.

Estudios morfoanatómicos.

Para determinar la existencia de diferencias morfológicas y/o anatómicas, entre plántulas obtenidas in vitro a partir de microesquejes, y las plantas donantes (adultas y jóvenes) crecidas in vivo, se realizaron observaciones comparativas del tallo, hojas y raíz de ambos tipos de plantas. Las observaciones de órganos y tejidos se hicieron en material vegetal fresco o preservado en etanol 70%.

Para los estudios anatómicos se cortó el material a mano suelta y se tiñó con azul de tolouidina. Con estos cortó se prepararon láminas semipermanentes (glicerina 50%). Las preparaciones se observaron en un microscopio leitz y se hicieron registros fotográficos con una cámara incorporada a un microscopio Wild-Heerbrugg.

Resultados

Crecimiento de microesquejes aislados de plantas obtenidas in vitro.

En general, se observó que los nudos apicales presentaron mayor porcentaje de explantes que producían brotes (93,06%) en relación al conjunto de los nudos no apicales (44,01%); la misma tendencia se presentó con respecto al número de brotes producidos por explante. Además, los nudos correspondientes a distintos niveles del vástago presentaron diferencias en el porcentaje de explantes con brotes, ordenándose de la manera siguiente:

 

Nudo apical (93,06%)

Segundo nudo (46,15%)

Sexto nudo (83,30%)

Décimo nudo (33,33%)

Quinto nudo (56,25%)

Tercer nudo (2C%)

Séptimo nudo (50,08%)

Octavo nudo (25%)

Cuarto nudo (48%)

Noveno nudo (25%)

 

E1 100% de los nudos apicales producen brotes con cualquiera de las concentraciones de BAP ensayadas (entre 3 y 16 mg/1) (Figure 1); en los nudos subyacentes solamente se logra la brotación en un máximo de 62,5% y lo hacen a una alto concentración de BAP de 12 mg/1 (Cuadro 3). Además, mientras los nudos apicales alcanzan un promedio máximo de cuatro brotes por explantes con 4, 10 ó 12 mg/1 de BAP, al cabo de tres meses de cultivo, los nudos subyacentes solo alcanzan un promedio máximo de 2,5 brotes por explante a concentraciones de BAP entre 10 y 16 mg/1.

En cuanto al número de explantes obtenidos a partir del microesqueje inicial (rendimiento), en función de la concentración de BAP, se observaron los mayores valores en los nudos apicales, llegando a 17,2 explantes por microesqueje inicial con 4 mg/1 de BAP; mientras que los nudos no apicales alcanzaron un promedio de 10,0 expl./expl. inicial y esto con 16 mg/1 de BAP. La adición de ANA (0,5 mg/1) a los medios con 4, 8 y 10 mg/1 de BAP resultó en un incremento del porcentaje de explantes con brotes (Cuadro 3, fig. 2)

En el conjunto general de microesquejes, nudos apicales y subyacentes, procedentes de vástagos producidos in vitro, se observó que el porcentaje de "explantes con desarrollo de brotes", incrementaba a medida que la concentración de BAP en el medio de cultivo era gradualmente aumentada de 0 a 12 mg/1, observándose una ligera declinación con 16 mg/1 (Cuadro 4). Una tendencia parecida se observó en el promedio de "brotes producidos por explante" (Cuadro 4). La prueba de KUSKAl-WAllIS (15) aplicada a estos dates indicó que las diferencias en el porcentaje de "explantes con brotes" y en el promedio de "brotes por explantes", encontrados entre las distintas concentraciones de BAP ensayadas, son estadísticamente significativas (con = 0,05)

Fig. 1. Nudo apical procedente de planta de in vitro desarrollándose en medio suplementado con 4 mg/1 de BAP. Presenta siete brotes con un máximo de cinco pares de hojas (tres mesas de cultivo.
Fig. 1. Nudo apical procedente de planta de in vitro desarrollándose en medio suplementado con 4 mg/1 de BAP. Presenta siete brotes con un máximo de cinco pares de hojas (tres mesas de cultivo.

 

 

Fig 2. Microesquejes procedentes de vástago obtenido in vitro en medio suplementado con 4 mg/1 de BAO y 0,5 mg/1 de ANA, desarrollándose ahora en medio con 10 mg/1 de BAP. Presenta múltiples brotes (en su parte superior) y seis raíces (en su parte superior) (tres meses de cultivo).
Fig 2. Microesquejes procedentes de vástago obtenido in vitro en medio suplementado con 4 mg/1 de BAO y 0,5 mg/1 de ANA, desarrollándose ahora en medio con 10 mg/1 de BAP. Presenta múltiples brotes (en su parte superior) y seis raíces (en su parte superior) (tres meses de cultivo).
 
CUADRO 3. Evaluación del efecto de la concentración de BAP y ANA sobre el desarrollo de microesquejes de plantas crecidas in vitro.

BAP

ANA

X explantes por expl.

X PDH

% explantes con brotes

Rendimiento

mg/l

mg/l

NA

NS

NA

NS

NA

NS

NA

NS


-

-

0,78

0,06

1,6

2

77,8

5,6

1,2

0,1

2

-

2,1

0,18

3,3

1

100

10

6,9

0,18

4

-

4

1,4

4,3

1,4

100

36

17,2

1,9

4

0,5

1,5

0,97

2,6

2,5

91,7

48,6

3,9

4,2

8

-

2,7

0,62

3,3

1,5

100

30,8

8,9

0,93

8

0,5

3,3

1,40

3

2,1

100

61,5

9,9

2,94

10

-

4

2,1

4

2

100

57,1

16

4,2

10

0,5

3,2

1

3,6

0,91

100

68,8

11,5

0,91

12

-

4

1,9

4

1,8

100

62,5

16

3,42

16

-

3

2,5

3,3

4

100

45,5

9,9

10


NA: Nudo apical ND: Nudo subyacente PDH: Pares de hojas

En relación al estado físico del medio, se encontraron, al cabo de dos mesas de cultivo, mayores porcentajes de oxidación entre aquellos explantes sembrados en medio sólido (50,9%) que entre los sembrados en medio liquido (31,4%). Las plántulas una vez enraizadas fueron pasadas a tierra y mantenidas en un ambiente húmedo, donde continuarían desarrollándose (Figure 3).

Crecimiento de microesquejes aislados de plantas obtenidas in vitro.

Los explantes provenientes de plantas crecidas in viva bajo condiciones controladas presentaron poco problemas de oxidación y contaminación. Con respecto al tratamiento de desinfección y antioxidación aplicados a estos explantes, se observó que el método seguido permitía disminuir en gran porcentaje la oxidación y la contaminación fungal y bacterial.

 

CUADRO 4. Evaluación del efecto de h concentración de BAP sobre el desarrollo (nudos apicales + nudos subyacentes) procedentes de plántulas y vástagos obtenidos in vitro.

BAP

% expl. con brotes

X brotes/expl.

mg/l

Tipo I

Tipo II

Tipo I

Tipo 11


0

29,6

-

0,3

-

2

29,4

-

0,6

-

4

42,9

25

1,7

0,5

8

43,8

60

1

1,6

10

65,4

62,5

2,4

1,1

12

70

70

2,3

1,5

16

57,2

40

2,6

1


Tipo 1: explantes procedentes de plántulas obtenidas in vitro por embriogénesis somática.

Tipo II: explantes procedentes de vástagos producidos in vitro a partir de microesquejes de plantas de in vivo.

 

Fig. 3. Vástago producido y enraizado in vitro, continuando su desarrollo en tierra, después de un mes del transplante.
Fig. 3. Vástago producido y enraizado in vitro, continuando su desarrollo en tierra, después de un mes del transplante.

 

Efecto del estado físico del medio de cultivo.

Mayores porcentajes de contaminación y oxidación se presentaron entre los explantes sembrados en medio sólido que entre los del medio liquido. De tal forma que a la semana de sembrados se observó un 8,3% de oxidación y un 52% de contaminación bacteriana entre los explantes que se encontraban en el medio sólido, mientras que entre los sembrados en medio líquido aún no se presentaba ningún explante afectado.

Evaluación del crecimiento de los microesquejes.

Independientemente del origen del microesqueje (plantas de in vitro o de in viva), y del suplemento hormonal empleado, el porcentaje de explantes con brotes fué siempre superior, cuando el mismo estaba constituido por nudos apicales que cuando estaba constituido por nudos secundarios.

los nudos apicales (adultos y jóvenes) no mostraron marcadas variaciones en el porcentaje de explantes con brotes, ni en el promedio de "brotes por explante" en función de la concentración de BAP (entre 4 y 16 mg/1). Lo mismo se observó con respecto a los nudos secundarios (Cuadro 5).

En cuanto al rendimiento o número de nuevos explantes que se pueden obtener a partir de cada explante original en tres meses de cultivo, el cual depende tanto del número de brotes producidos, como del número de pares de hojas de dichos brotes, se observó que aquellos procedentes de plantas adultas resultaron en general más productivos que los de plantas jóvenes. Así, mientras el máximo valor alcanzado por nudos apicales de plantas adultas era de 13,2 explantes/explante original (con 4 mg/1 de BAP), los de plantas jóvenes sólo llegaron a 1,9 expl./expl. orig. (con 8 mg/1 de BAP).

 

CUADRO 5. Evaluación del efecto de la concentración de BAP y ANA sobre el desarrollo de microesquejes de plantas adultas y jóvenes crecidas in vitro.

 

 

X brotes por explante

X por de hojas/brote

Rendimiento

BAP

ANA

NAA

NAJ

NAA

NSJ

NAA

NAJ

NSA

NSJ

NAA

NAJ

NSA

NSJ

mg/l

mg/l

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


4

-

12

1

1,3

0,9

1,1

1

1,8

1,7

13,2

1,0

2,3

1,5

4

0,5

0,7

1

1,5

-

1

1,7

2

-

0,7

1,7

3,0

-

8

-

0,9

1,3

0,3

0,5

2,4

1,5

2

1,3

2,2

1,9

0,6

0,7

8

0,5

1,3

1

1,3

1,3

1,3

1,3

2

1

1,7

1,3

2,6

1,3

10

-

1,8

0,8

1,2

-

1,6

1

2,3

-

2,9

0,8

2,8

-

10

0,5

0,5

1

4

-

1

2,5

2

-

0,5

2,5

8,0

-

12

-

1,2

1

1,1

0,3

3,0

0,8

2

0,8

3,6

0,8

2,2

0,2

16

-

1,5

0,9

2

-

2

1

3,2

-

3,0

0,9

6,4

-


NOTA:

 

NAA = Nudo apical de plantas adultas

N31 = Nudo secundario de planta joven

NSA = Nudo secundario de planta adulta

Rendimiento = Número de nuevos expiantes que se pueden

NAJ = Nudo apical de planta joven

obtener a partir de un explante inicial

 

 
Fig. 4. Vástago producido in vitro a partir de un nudo secundario de planta adulto de in viva cultivado en medio con 16 mg/l de BAP. Presenta un tallo verde, blando, de aproximadamente 0,15 cm de diámetro y 2 cm de alto, con cinco pares de hojas (cuatro meses de cultivo)
Fig. 4. Vástago producido in vitro a partir de un nudo secundario de planta adulto de in viva cultivado en medio con 16 mg/l de BAP. Presenta un tallo verde, blando, de aproximadamente 0,15 cm de diámetro y 2 cm de alto, con cinco pares de hojas (cuatro meses de cultivo)
.

Los nudos secundarios de plantas adultas produjeron hasta 6,4 expl./ expl. orig., con 16 mg/1 de BAP (Fig. 4), mientras que aquellos procedentes de plantas jóvenes sólo alcanzaron el valor de 1,5 (con 4 mg/1 de BAP) (Cuadro 5). Los microesquejes de mayor rendimiento fueron los obtenidos de plantas crecidas in vitro, con un máximo de 17,7 expl./expl. orig.

Al comparar el promedio de "brotes producidos por explante" de los microesquejes de plantas obtenidas in vitro (Cuadro 4) con los de los microesquejes de plantas producidas in viva (Cuadro 6), se observe que para todas las concentraciones de BAP, los primeros resultaron más productivos que los segundos. La prueba de KOlMOGOROV-SMIRNOV (15), aplicadas a estos dates indica que las diferencias encontradas entre ambos tipos de explantes son estadísticamente significativas (0,05).

 

CUADRO 6. Evaluación del efecto de la concentración de BAP y ANA en el desarrollo de nudos apicales + nudos secundarios de plantas adultas y jóvenes de in viva.

 

.

% de exp. con brutas

X brotes/expl

BAP

ANA

Adultas

Jóvenes

Adultas

Jóvenes


4

-

76,5

60

1,2

0,9

4

0,5

75

60

0,9

0,6

8

-

37,5

55,6

0,7

0,9

8

0,5

50

66,7

1,3

1,2

10

-

64,3

18,8

1,4

0,3

10

0,5

66,7

40

1,7

0,4

12

-

61,5

42,2

1,2

0,4

16

-

76,9

38,9

1,8

0,4


Aspectos morfoanatómicos de los órganos originados in vitro.

 

Los vástagos enraizados in vitro no presentan una raíz axonoforma, sino varias raíces adventicias principales (tres o cuatro), de las que se originan otras secundarias. Estas raíces, a diferencia de las obtenidas in viva, presentan poco engrosamiento en las paredes del xilema, el cual forma solo cuatro rayos en lugar de seis. En los cortes realizados en la base de los vástagos enraizados se observó que las raíces adventicias se originaban del cilindro vascular del tallo, y no del callo formado en dicha zona.

Los vástagos obtenidos in vitro, al cabo de tres meses de formados, presentan tallos verdes, blandos y de pocos milimetros de diámetro (1-2 mm). Anatómicamente se pudo observar que carecen de anillo esclerenquimático alrededor del cilindro vascular, así como de crecimiento secundario: corcho, xilema y floema secundarios. |

las hojas de los vástagos producidos in vitro conservan la misma filotaxis decusada y generalmente la misma forma y características de las hojas de plantas crecidas in viva. Sin embargo, ocasionalmente se pudo observar la aparición de hojas aciculadas, irregulares, amarillentas y/o con la lamina foliar anómala (Fig. 5). Las diferencias presentadas desde el punto de vista anatómico son las siguientes: cutícula más delgada, células del parénquima de empalizada más corta; parénquima esponjoso con sólo cuatro o cinco capes, sin llegar nunca a seis capes como en las plantas de in vivo; cilindro vascular del nervio central abierto, xilema y floema más escasos, poco engrosamiento en las paredes del xilema, ausencia del anillo esclerenquimático alrededor del cilindro vascular del nervio central, carencia de cilindros accesorios. Además, en vista superficial, las células de la epidermis inferior presentaban paredes rectas, en contraste con las paredes onduladas de las hojas de in viva y son frecuentes los estomas en distintos estados de desarrollo y con formas anómalas: ausencia de una o ambas células oclusivas o acompañantes, así como desigualdad de forma y tamaño entre éstas (Fig. 6).

Fig. 5. Vástago producido in vitro a partir de nudo apical de planta adulta, mostrando forma anómala de las hojas.
Fig. 5. Vástago producido in vitro a partir de nudo apical de planta adulta, mostrando forma anómala de las hojas.

 

 
Fig. 6. Vista superficial de la epidermis abaxial de una hoja de vástago producido in vitro, mostrando las paredes celulares rectas y la forma anómala de los estomas (aumento 400X).
Fig. 6. Vista superficial de la epidermis abaxial de una hoja de vástago producido in vitro, mostrando las paredes celulares rectas y la forma anómala de los estomas (aumento 400X).

 

DISCUSION

Análisis del efecto del nivel del nudo, origen y edad de la planta donante, y balance hormonal del medio de cultivo, sobre el desarrollo del explante in vitro.

El hecho de que el mayor porcentaje de explantes que logran producir brutas in vitro se presenta entre los nudos apicales, independientemente del origen del material donante, es posible explicarlo como una consecuencia del fenómeno de la dominancia apical, la cual se ha observado en gran número de especies vegetales.

Diversas investigaciones han revelado el papal primordial que juega el balance endógeno auxina/citocinina en la regulación de la brotación de las yemas laterales. Es generalmente aceptado que las auxinas sintetizadas en las hojas jóvenes de la yema apical son transportadas basipétalamente hacia las yemas laterales, y constituyen la principal señal correlativa que regula la síntesis de citocininas, su distribución o su utilización en estas yemas. De esta manera, la inhibición del crecimiento de las yemas laterales es una consecuencia del déficit de citoquininas, lo que impide alcanzar el balance adecuado auxina/citocinina para la inducción del crecimiento del brote (3, 8, 12).

En el caso de los explantes procedentes de plántulas crecidas in vitro a partir de embriones somáticos, se observó que el efecto regulador del ápice se manifiesta con mayor intensidad en los nudos que ocupan el segundo y tercer nivel, disminuyendo esta inhibición a partir del quinto nudo, lo que hace pensar que de nuevo el balance endógeno auxina/citocinina es adecuado, hasta el punto de permitir un alto porcentajes (83,3%) de brotación en los nudos del sexto nivel. En este sentido y con el propósito de eliminar los efectos de la dominancia apical, que como se ve, se mantiene aún en el material cultivado in vitro, se podría recurrir a separar la yema apical cierto tiempo antes de la extracción de los demás nudos, según lo sugieren BRESSAN et al. (3).

La tendencia a una mayor producción de brotes por explantes en aquellos procedentes de plantas in vitro (Cuadro 4), que en los procedentes de plantas crecidas in viva (Cuadro 6), refleja la existencia de diferencias en el contenido hormonal endógeno de ambos tipos de explantes, y consecuentemente de la capacidad morfogenética del tejido, determinadas por el grado de madurez del material donante. Se sabe, y los estudios anatómicos realizados en este trabajo así lo demuestran, que las plantas mantenidas in vitro conservan características juveniles que in viva se pierden a medida que la planta alcanza su madurez.

Los cálculos realizados basados en los resultados obtenidos en este trabajo, indican que el número máximo de vástagos que con la metodología descrita es posible obtener en un año, a partir del nudo apical y un nudo secundario de una plántula obtenida in vitro, por embriogénesis somática, es casi el doble (10 985 vástagos) del que podría obtenerse partiendo de los mismos explantes extraídos de una planta de in viva (5 739 vástagos).

Sin embargo, hay que tomar en cuenta lo que señala DUBlIN (4) acerca del mayor riesgo de alteraciones genómicas que presentan las plantas obtenidas por embriogénesis somática, por observarse durante este proceso una fase de callo indiferenciado. De esta manera, se puede considerar que los explantes obtenidos directamente de las plantas in viva ofrecen mayores garantías de conformídad genética, lo cual es muy importante sobre todo cuando se de sea propagar plantas que han sido seleccionadas por poseer un genotipo o de particular interés, como es el case del cultivar Catimor.

Rendimiento del cultivo de microesquejes de Catimor.

Las ventajas del cultivo de microesquejes se evidencian al comparar el potencial reproductivo de este método (de 5 793 a 10 985 vástagos en un año), con el obtenido en condiciones hortícolas convencionales (100 a 200 vástagos en dos años) (5, 6).

Aunque aún queda macho que investigar para superar los problemas que acarrea el cultivo in vitro del café, y lograr establecer una metodología que permita el máximo rendimiento, se puede decir que la propagación vegetativa in vitro a partir de expalntes caulinares es una alternativa prometedora.

En general, es posible obtener plantas completes a partir de los vástagos producidos in vitro, enraizando éstos en un medio con las sales MS diluidas a la mitad, una baja concentración de sacarosa (10 g/1) y AIB (10 mg/1).

la técnica de cultivo in vitro de explantes caulinares es un método que debe incorporarse a los programas de propagación masiva de cultivares de café seleccionados, como el Catimor, debido al alto coeficiente de multiplicación que posee dicha técnica, en comparación con los métodos hortícolas convencionales.

SUMMARY

Cofeea arabica cv. 'Catimor' is resistant to a wide range of races of the rust fungus, it also has desirable agronomic characteristics and produces good quality coffee. Base on these prominent features, the massive vegetative propagation of this cultivar sesms to be promising in countries with rust problems to produce rust free coffee. In this paper we analyzed the nutritional and environmental requirements to micropropagate Coffea arabica cv. Catirnor. Propagation wes achieved by culturing microcutting of orthotropic and plagyotropic shoots, obtained from the field and from plantlets grew in the laboratory by in vitro culture. Also it was studied the influence of growth conditions of the donor plants, and the effect of the original position of the cutting in the donor shoot, on the growth of the microcutting. In the explants (microcutting isolated from shoots obtained from the field, serious oxidation was observed, which was controled: a) by placing the donor plants under low light intensity, b) by treating the explants with ascorbic acid (300 mg/1) and c) by growing these explants in liquid medio with cistein (60 mg/1). We found that microcutting with apical node, isolated from plantlets grown in vitro had better capacity to develop buds than the microcutting with secondary nodes. High BAP concentrations (12 to 16 mg/1) are necessary to induce the bud growth. The microcuttings with buds increases from 5.6% in medio without BAP, to 62% in medio with high BAP concentration. Morphoanatomic analysis of three months old plants, showed that they preserve characteristics of juvenility in comparison with plants of same age obtained from seeds. Potentialy with this method we can produce bet~veen 5,793 to 10,985 shoots in one year, in comparison with 100 to 20 shoots that can be obtained by horticultural methods.

K W.: Coffaa arabica, tissue culture, microcutting.

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